11480022001

Tth DNA-Polymerase

pkg of 500 U (2 x 250_U), sufficient for ≤200 reactions

• Synonym(e): DNA-Polymerase, Polymerase
• EC-Nummer: 2.7.7.7 (BRENDA, IUBMB)
• UNSPSC-Code: 41106314

Eigenschaften

• Biologische Quelle: bacterial (Thermus thermophilus)
• Qualitätsniveau: 100
• Rekombinant: expressed in E. coli
• Form: liquid
• Verwendung: sufficient for ≤200 reactions
• Spezifische Aktivität: 5 U/μL
• Verpackung: pkg of 500 U (2 x 250_U)
• Hersteller/Markenname: Roche
• Konzentration: 0.5-5.0 units (per reaction for PCR (standard)); 2.5 units (per reaction for PCR (standard))
• Parameter: 75 °C optimum reaction temp.
• Methode(n): PCR: suitable; RT-PCR: suitable; nucleic acid labeling: suitable
• Farbe: colorless
• Optimaler pH-Wert: ~9.0 (25 °C)
• Löslichkeit: water: miscible
• Eignung: suitable for molecular biology
• UniProt-Hinterlegungsnummer: P30313
• Anwendung(en): life science and biopharma
• Fremdaktivität: Endonuclease, none detected (up to 20 enzyme units using Lambda-DNA/ 16h/37°C); Nicking activity, none detected ( up to 20 enzyme units using pBR322-DNA / 16h/37°C); RNases, none detected (up to 20 enzyme units using MS II-RNA; 4h/37°C)
• Lagertemp.: −20°C

Beschreibung

Allgemeine Beschreibung

Die Tth-DNA-Polymerase wird aus dem thermophilen Eubakterium Thermus thermophilus HB8 isoliert und vollständig von nicht spezifischen DNasen und RNasen gereinigt. Das Enzym ist eine hochprozessive 5′-3′-DNA-Polymerase ohne 3′-5′-Exonuklease-Aktivität. Das Enzym übt seine höchste Aktivität bei einem pH von ca. 9 (eingestellt bei +25 °C) und Temperaturen um +75 °C aus. Es ist resistent gegen längere Inkubationen bei hohen Temperaturen (+95 °C).

Anwendung

Die Thermus-thermophilus-DNA-Polymerase (Tth-DNA-Polymerase) kann verwendet werden:

• zur Amplifikation von DNA-Fragmenten mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) aufgrund ihrer Resistenz gegenüber längeren Inkubationszeiten bei hohen Temperaturen (95 °C)
• zur Markierung von DNA-Fragmenten entweder mit radioaktiv markierten Nukleotiden, Digoxigenin oder Biotin, da dieses Enzym modifizierte Desoxyribonukleotide als Substrate akzeptiert
• zur effizienten Transkription von RNA-Targets in cDNA aufgrund seiner intrinsischen Mn-abhängigen Reverse-Transkriptase-Aktivität (RT-Aktivität)
• für Echtzeit-PCR

Biochem./physiol. Wirkung

Die Thermus-thermophilus-DNA-Polymerase (Tth-DNA-Polymerase) ist eine thermostabile DNA-Polymerase mit intrinsischer Reverse-Transkriptase-Aktivität (RT-Aktivität). Das Enzym ist eine hochprozessive 5′-3′-DNA-Polymerase ohne 3′-5′-Exonuklease-Aktivität (Korrekturlesen). Bei diesem wurde in Anwesenheit von Mangan-Ionen eine sehr effiziente intrinsische Reverse-Transkriptase-Aktivität (RT-Aktivität) nachgewiesen, die wesentlich höher war als die für die Escherichia-coli-DNA-Polymerase I und die Taq-DNA-Polymerase nachgewiesene Aktivität. Die RT-Aktivität ist nicht mit der RNase-H-Aktivität assoziiert. Die durch die RNA-Sekundärstruktur verursachten Probleme werden durch die erhöhten Temperaturen der Tth-DNA-Polymerase-Aktivität (optimal +55 °C bis +70 °C, maximal +95 °C) ausgeglichen. Die daraus resultierende cDNA kann mit PCR amplifiziert werden, indem in Anwesenheit von Mg²⁺-Ionen dasselbe Enzym zum Einsatz kommt. Da die Tth-DNA-Polymerase in der Lage ist, sowohl eine Reverse-Transkription als auch eine DNA-Amplifikation bei erhöhten Temperaturen auszuführen, kann dieses Enzym für eine quantitative RT-PCR, zum Klonen und für die Genexpressionsanalyse von zellulärer und viraler RNA verwendet werden. Die Tth-DNA-Polymerase wird zur RT-PCR-Amplifikation von RNA bis 1 kb eingesetzt.

Leistungsmerkmale und Vorteile

Tth-DNA-Polymerase

• Gewährleistet eine optimierte PCR-Produktgröße für mindestens bis zu 1.000 bp in einer RT-PCR-Reaktion
• Akzeptiert modifizierte Desoxyribonukleosidtriphosphate als Substrate
• Ist nicht mit der RNase-H-Aktivität assoziiert
• Hat eine hohe Thermostabilität zur Behebung des Problems, das typischerweise mit dem hohen Grad an Sekundärstruktur in RNA verbunden ist

Verpackung

1 Kit mit 3 Komponenten

Qualität

Jede Charge der Tth-DNA-Polymerase wird auf Aktivität bei aktivierter DNA getestet. Es wird ein Funktionstest mit ?DNA und mit humangenomischer DNA ausgeführt. Die Leistung bei der RT/PCR wird mit Gesamt-Maus-RNA und spezifischen Primern für ?-Aktin getestet. Jede Charge der Tth-DNA-Polymerase wird gemäß den aktuellen Qualitätskontrollverfahren auf die Abwesenheit kontaminierender Aktivitäten wie zum Beispiel Exo- und Endonukleasen und Nicking-Aktivitäten getestet. Ein besonderer Selbst-Priming-Assay gewährleistet die Abwesenheit von kontaminierender DNA gemäß den aktuellen Qualitätskontrollverfahren.

Einheitendefinition

Eine Einheit der Tth-DNA-Polymerase ist als die Enzymmenge definiert, die innerhalb von 30 Minuten bei +70 °C unter den unter „Assay“ angegebenen Assay-Bedingungen den Einbau von 10 nmol der gesamten dNTPs in säurefällbare DNA katalysiert.

Assay: Inkubationspuffer für Assay von aktivierter DNA
67 mM Tris-HCI, pH 8,8 (+25 °C), 16,6 mM (NH₄)₂SO₄, 6,7 mM MgCl₂, 10 mM 2-Mercaptoethanol, jeweils 0,2 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP.

Inkubationsverfahren
12,5 μg aktivierte Heringssperma-DNA und 0,1 μCi [α³²P] dCTP werden mit 0,01 bis 0,1 Einheiten Tth-DNA-Polymerase in 50 μl Inkubationspuffer mit einem Paraffinöl-Overlay 30 Minuten lang bei +70 °C inkubiert.
Die Menge der eingebauten dNTPs wird mithilfe von Trichloressigsäureausfällung und anschließender Szintillationszählung bestimmt.

Volumenaktivität: 0,5 bis 5 U pro Reaktion bei der PCR (optimal)
2,5 U pro Reaktion bei der PCR (Standard)
Nachgewiesen in dem unter „Assay“ beschriebenen Assay von aktivierter DNA.

Sonstige Hinweise

Nur für die Life-Science-Forschung. Nicht zur Verwendung in diagnostischen Verfahren vorgesehen.

Rechtliche Hinweise

Die Verwendung dieses Produkts unterliegt US-Patentansprüchen und entsprechenden Patentansprüchen außerhalb der USA. Der Erwerb dieses Produkts umfasst eine beschränkte, nicht übertragbare Immunität gegenüber Rechtsschutzverfahren gemäß solchen Patentansprüchen für den ausschließlichen Gebrauch dieser Menge des Produktes für eigene interne Forschungsanwendungen des Käufers. Es wird weder ausdrücklich noch implizit oder durch Rechtsverwirkung ein Rechtsanspruch unter anderen Patenten und ein Rechtsanspruch zur Erbringung kommerzieller Leistungen jeglicher Art übertragen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf das Berichten der Ergebnisse aus den Aktivitäten des Käufers gegen Entgelt oder andere kommerzielle Gegenleistungen. Dieses Produkt ist nur für Forschungszwecke vorgesehen. Diagnostische Verwendungen nach Roche-Patentansprüchen erfordern eine gesonderte Lizenz von Roche. Weitere Informationen über den Erwerb von Lizenzen erhalten Sie vom Director of Licensing, Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, California, 94404, USA.

Nur Kit-Komponenten

• PCR Buffer, including MgCl₂ 10x concentrated
• RT-PCR Buffer, coupled reaction in one tube 5x concentrated
• Mn(OAc)₂-Solution 25 mM

Sicherheitshinweise

• Lagerklassenschlüssel: 12 - Non Combustible Liquids
• WGK: WGK 1
• Flammpunkt (°F): does not flash
• Flammpunkt (°C): does not flash