PCRの実践

一般的な考慮事項

RT-PCRに特異的な事項

キャリーオーバーコンタミネーションの防止
- ウラシルDNAグリコシラーゼによるキャリーオーバーコンタミネーションの防止
- RT-PCRにおけるキャリーオーバーコンタミネーションの防止

トラブルシューティング

一般的な考慮事項

コンタミネーション回避のためのラボセットアップ

ポリメラーゼ連鎖反応には1個の分子でも増幅できる能力があります。これは、ごく微量のDNA夾雑物でもテンプレートとして機能し、誤ったテンプレートが増幅され、偽陽性となる恐れを示唆しています。以下の汚染源由来のコンタミネーションが多くの実験室で発生しています。

実験室のベンチや機器、ピペッティング装置が、前回のDNA調製物やプラスミドDNA、精製された制限酵素断片などにより汚染されている
サンプル間のクロスコンタミネーション
前回のPCR増幅反応由来の産物

実験室施設

少なくとも以下の作業には、物理的に隔離された作業スペースを確保してください。
- PCR前のテンプレート調製
- PCR反応液の準備
- PCR後の解析
DNaseおよびRNaseフリーの thin-walled PCR tubes を使用してください。
特殊なエアロゾル耐性ピペットチップとPCR専用のピペットセットを使用します。できれば容積式ピペットを用意してください。
可能であれば、UV照射装置を備えたドラフト下でPCR反応液を準備します。ドラフト下には、PCR専用の微量遠心機と使い捨て手袋を常備してください。

サンプル処理

PCRエリアで作業をする際には、無菌技術を用い、常に新しい手袋を着用してください。手袋は頻繁に交換し、特にテンプレートDNAを含む溶液で汚染されたことが疑われる場合は必ず交換してください。
PCR試薬やテンプレートDNAを調製するためのガラス器具やプラスチック器具、ピペットは必ず、滅菌済みの新品を使用してください
性能への影響のないオートクレーブ可能な試薬と溶液に対しては、すべてオートクレーブを実施してください。当然ですが、プライマー、dNTP、Taq DNAポリメラーゼはオートクレーブ処理してはいけません。実験にはPCR作業専用の試薬類を用意し、試薬はあらかじめアリコートに小分けしておくのが理想的です。
DNAをピペット操作する際は、夾雑物を保持する可能性のあるエアロゾルを発生させないように注意してください。
たとえば、（テンプレートDNAを除く）すべての反応成分を含むネガティブコントロールなどのコントロール反応液や、前回のPCRで使用して有効であったポジティブコントロールを、必ずサンプルに含めるようにしてください。

特殊装置

サーマルサイクラーのタイプ

サーマルサイクラーは少なくとも、3つのPCRインキュベーション温度（「標準的PCRにおけるサーマルサイクリングプロファイル」を参照）を正確に再現性よく維持し、1つの設定温度から別の設定温度へと指定可能な時間で変化（「上昇」）し、大幅なオーバーシュートやアンダーシュートなしに選択した温度に達し、温度間を繰り返し再現性よく循環できなければなりません。

注記：サイクリング条件は、各サーマルサイクラーまたはプライマーテンプレートの組み合わせに応じて調整する必要があります。

反応チューブのタイプ

反応チューブは、サーマルサイクラーから反応混合液への熱伝導に影響を及ぼします。そのため、PCR用に設計された、お使いのサーマルサイクラーのウェルにぴったりはまる thin-walled reaction tube をなるべく使用してください。

PCR反応成分

テンプレート

テンプレートの品質はPCRの成績に影響を及ぼします。たとえば、DNAテンプレート中の大量のRNAはMg²⁺をキレート化し、PCRの収量を低下させます。また、不純なテンプレートはポリメラーゼの阻害物質を含み、反応効率を低下させる可能性があります。

注記：テンプレートの純度を最大限に高めるため、高純度PCRテンプレート精製キットなど、DNA精製用に特化して設計された精製用製品を常に用いるようにしてください。

テンプレートの完全性も重要です。テンプレートDNAは高分子量のものであることが必要です。DNAのサイズおよび品質の確認では、アガロースゲルに反応産物の一部を泳動してください。新しいテンプレートを試験する際は、既知サイズのPCR産物を増幅し、良好な収量を確保できるプライマーによるポジティブコントロールを常に含めるようにします。

反応液中のテンプレート量は、PCRのパフォーマンスを大きく左右します。標準的なPCRの推奨テンプレート量は以下のとおりです。

ヒトゲノムDNAでは最大500 ng
細菌DNAでは1～10 ng
プラスミドDNAでは0.1～1 ng

たとえば、10 ng未満のヒトゲノムDNAなど、低量のテンプレートは、サイクル数の変更やプライマーの再設計、ホットスタート法の利用など、反応方法に特殊な変更を要する場合があります。

プライマー

PCRが使用されるほとんどのケースで、アッセイの全般的な成否を決定するのは、プライマーの配列と濃度です。市販のプライマー設計ソフトウェアを用いて、プライマー配列が以下の一般的特性を満たしているかどうかを確認できます。

18～24塩基長
内部二次構造がない
G/C含有量40～60%
G/CおよびA/Tリッチ領域の分布のバランスが取れている
3´末端が相補的ではない（プライマーダイマーが形成されない）
アニーリング温度を55～65℃とすることが可能な融解温度（Tm）（特異性を最大限に高めるには、62～65℃の温度を使用してください）

注記：最適なアニーリング温度は、プライマーのTmより高い（約5～10℃）ことが多く、経験的に決定する必要があります。両プライマーのTmは同等にする必要があります。

テンプレートにハイブリダイズしない塩基がプライマーの5´末端に添加されることもあります（例：増幅産物に制限酵素部位を導入するため）。一般にプライマー濃度は0.1～0.6 µMが最適です。これより高いプライマー濃度では、ミスプライミングや非特異的産物の蓄積が促進されることがあります。またプライマー濃度が低いと、反応が完了する前にプライマーが枯渇し、目的の産物の収量が低くなる可能性があります。

注記：一部のシステムでは、プライマー濃度を上げると（最高1 µM）結果が改善されることがあります。新しいプライマーを試験する際は、PCRで機能試験済みであるテンプレートによるポジティブコントロール反応を常に組み込んでください。このコントロールにより、プライマーが機能するかどうかが示されます。RocheのHuman Genomic DNAは、ヒトプライマー配列を評価するための優れたコントロールテンプレートです。

DNAポリメラーゼの選択

DNAポリメラーゼの選択は、PCRの成績に甚大な影響を及ぼす可能性があります。大部分のPCRアッセイでは、Taq DNAポリメラーゼが標準的な酵素として長年使われてきました。しかし、Taq DNAポリメラーゼにも制限事項はあります。ほとんどのアッセイで、熱安定性ポリメラーゼ（またはポリメラーゼミックス）の最適量は反応容量50 µLあたり0.5～2.5 Uの間となります。必要以上に酵素濃度を上げると、特異性が低下する場合があります。

MgCl₂濃度

Mg²⁺はdNTPと可溶性複合体を形成し、ポリメラーゼによって認識される実際の基質を生成します。遊離型Mg²⁺濃度は、dNTPや遊離型ピロリン酸（Ppi）、EDTAなど、Mg2+に結合する化合物の濃度に依存します。最良の結果を得るためには、最適なMg²⁺濃度を常に経験的に決定する必要があります。最適なMg²⁺濃度は約1～5 mMの間とさまざまです。最もよく使用されるMg²⁺濃度は1.5 mM（dNTP濃度はそれぞれ200 µM）です。Mg²⁺は酵素活性に影響を及ぼし、二本鎖DNAのTmを上昇させます。反応液中のMg²⁺が過剰な場合は、非特異的プライマー結合が増加し、結果的に非特異的バックグラウンドが高くなることがあります。

デオキシヌクレオシド三リン酸（dNTP）濃度

ポリメラーゼのエラー率を最小限にするために、4種類のdNTPの量が均等である溶液を用いるようにしてください。各dNTP量が不均衡な混合液では、Taq DNAポリメラーゼの精度が低下する可能性があります。

注記：PCR Nucleotide Mixなど、各dNTPがバランスよく調製されたプレミックス型混合液は、単一の試薬として反応混合液に添加することができ便利です。PCRグレードのdATP、dGTP、dCTP、dTTPやデオキシヌクレオシド三リン酸セット（PCRグレード）を個別に使用することもできます。

dNTP濃度を上昇させる場合は、Mg²⁺濃度も増加させなければなりません。dNTP濃度の増加によって遊離型²⁺が減少し、ポリメラーゼ活性が阻害され、プライマーのアニーリングが抑制されます。キャリーオーバーコンタミネーションを防止するため、通常は高濃度のdUTPがdTTPの代わりに用いられます（詳細は、「ウラシルDNAグリコシラーゼによるキャリーオーバーコンタミネーションの防止」を参照）。最終dNTP濃度は50～500 µM（各dNTP）となります。最も使用頻度の高いdNTP濃度は200 µMです。

一般に、対応する熱安定性DNAポリメラーゼに同梱される反応バッファーのpH（pH 8.3～9.0）により最良の結果が得られます。しかし、一部のシステムでは、pHを上昇させることによりテンプレートが安定し、結果が向上することがあります。

反応添加剤

一部の事例では、以下の化合物を添加することによりPCRの効率または特異性が向上することがあります。

ベタイン（0.5～2 M）
ウシ血清アルブミン（BSA、100 ng/50 µl）
界面活性剤
ジメチルスルホキシド（DMSO、2～10%）（v/v）
ゼラチン
グリセロール（1～5%）（v/v）
ピロリン酸（反応容量あたり0.001～0.1 U）
スペルミジン
T4 Gene 32タンパク質
ホルムアミド

標準的PCRにおけるサーマルサイクリングプロファイル

初期変性

テンプレートDNAを完全に変性することはきわめて重要です。PCR混合液の94～95℃での2分間の初期加熱は、複雑なゲノムDNAを完全に変性するのに十分であり、反応ミックスが冷却されるにつれてプライマーがテンプレートにアニーリングできるようになります。テンプレートDNAが部分的にしか変性されていない場合は、きわめて急速に「スナップバック」傾向にあり、効率的なプライマーアニーリングおよび伸長が阻害されたり、「セルフプライミング」が発生して偽陽性の結果が得られたりします。

サイクリング時の変性ステップ

通常は、94～95℃で20～30秒間の変性で十分と言われていますが、お使いのサーマルサイクラーやチューブにこの数値を最適化しなければなりません。たとえば、500 µLチューブでは200 µLチューブよりも長い加熱時間が必要です。変性温度が低すぎると、不完全に融解したDNAが前述のように「スナップバック」するため、プライマーと接触できなくなるからです。GCリッチなテンプレートDNAの場合、変性時間を長くするか、変性温度を上昇させてください。

注記：テンプレートDNAの完全変性に絶対的に必要とされる時間以上に、変性時間を延長しないでください。必要以上の変性時間はTaq DNAポリメラーゼの活性を低下させる恐れがあります。

プライマーアニーリング

大部分のPCRにおいて、アニーリング温度は経験的に最適化しなければなりません。高特異性PCRの設計では、プライマーアニーリング温度の選択が最も重要な因子となります。温度が高すぎるとアニーリングが起こらず、低すぎると非特異的アニーリングが劇的に増加します。プライマーが1つ以上の相補的塩基を有し、2つのプライマーの3´末端間で塩基対が形成されると、プライマーダイマーが発生してしまいます。

プライマーの伸長

3 kbまでの断片については、プライマーの伸長は通常72℃で行われます。72℃では、Taq DNAポリメラーゼにより1秒間あたり約60個の塩基が追加されていきます。1 kbまでの断片であれば45秒間の伸長で十分です。3 kbまでの断片の伸長には、1 kbあたり約45秒間が必要です。しかし、これらの時間は、テンプレートごとに調整する必要があると考えられます。収量の向上には、サーマルサイクラーの伸長特性を利用してください。たとえば、最初の10サイクルは一定の伸長時間（例：1 kbの産物あたり45秒間）で実施します。次の20サイクルは、伸長時間を1サイクルあたり2～5秒間延長します（例：サイクル11には50秒間、サイクル12には55秒間など）。PCRが進行するにつれて増幅されるテンプレートが増加し、（高いPCR温度で長時間経過し、生じる変性により）伸長を行う酵素が少なくなるため、サイクルを延長することによって、酵素が機能できる時間が長くなります。

サイクル数

最適な反応では、10個未満のテンプレート分子でも40サイクル未満で増幅され、その産物はエチジウムブロマイドにより染色されたゲルで容易に検出されます。このため、ほとんどのPCRはわずか25～35サイクルで実行されます。サイクル数が増加するにつれて、非特異的産物が蓄積される可能性も高まります（図1）。

図1.不純物を含むテンプレートと含まないテンプレートに対する過度のサイクリングの影響。PCR産物（ドーパミン2受容体遺伝子のエクソン6由来の245 bpアンプリコン）を一連の反応液で再増幅した。1つ目のエクスペリメントセットでは、テンプレートを使用前に精製せず、2つ目のセットでは、テンプレートを再増幅前にアガロースゲル電気泳動により精製した。どちらのセットにおいても、テンプレートは40、60、72回のサイクルのいずれかで増幅した。PCR産物の一部（8 µL）を3%アガロースゲル上で解析しました。

MWM：分子量マーカー
40、60、72：増幅サイクル数

結果：いずれのセットでも、最小サイクル数（40回）で最も特異的な産物が得られました。60回と72回の増幅では、多量体の「特異的」PCR産物を含むスメアが出現しました。
写真提供：U. Finckh and A. Rolfs, Free University of Berlin, Germany

最終伸長

通常、最後のサイクル終了後、マイクロチューブは72℃で5～15分間維持し、部分的伸長産物の完了と一本鎖の相補的産物のアニーリングを促進します。

PCR酵素の特性

表1に、Rocheが提供するPCR酵素の応用特性を示します。

RT-PCRに特異的な事項

RT-PCR酵素の選択

当然のことながら、RT-PCRで最優先に考慮すべき主なファクターは、cDNAの合成に用いるリバーストランスクリプターゼの選択となります。酵素にはそれぞれ異なる特性、すなわち特定の実験系への向き・不向きがあります。最も重要な酵素特性を以下に説明します。

至適温度

インキュベーション温度が高いと、テンプレートの二次構造という問題を取り除くのに役立ちます。また、高温ではミスプライミングが減るため、逆転写の特異性が向上します。すなわち高温（50～70℃）でインキュベートできる、熱活性の高い逆転写酵素のほうが、mRNAの正確なコピーを生成する可能性が高くなります。GC含量が高いテンプレートの場合は特に、この関係が当てはまります。

注記：高温状態では特異的プライマーのみを使用し、オリゴ（dT）またはランダムヘキサマープライマーを用いないでください。

二価イオンの要件

ほとんどの逆転写酵素は、その活性に2価イオンを必要とします。Mg²⁺を利用する酵素は、Mn²⁺を利用する酵素よりも正確なcDNAコピー数が多くなる傾向があります。これは、Mn²⁺がDNA合成の精度にネガティブな影響を及ぼすためです。

特異性と感度

逆転写酵素は、少量のテンプレートをコピーする能力（感度）、さらには、RNAの二次構造を正確に転写する能力（特異性）においても、それぞれ独自の特色を有しています。

酵素の特性

表2に、Rocheが提供するRT-PCR酵素およびキットの応用特性を示します。

表2.Rocheが提供するRT-PCR酵素およびキットの応用特性

逆転写プライマーの選択

プライミングは、生成されるcDNAのサイズおよび特異性に影響を及ぼします。逆転写に用いられる可能性のあるプライマーには3種類あります。

Oligo（dT）12～18：哺乳類mRNAの3´末端において内因性ポリ（A）+テールに結合します。本プライマーでは、完全長cDNAが作成されることが多くなります。
ランダムヘキサヌクレオチド：多様な相補的部位でmRNAに結合し、部分長（短い）cDNAが得られます。本プライマーは、テンプレートの広範な二次構造に起因する問題を克服するのに理想的であると考えられます。これらのプライマーはmRNAの5´領域も、より効率的に転写します。
特異的オリゴヌクレオチドプライマー：ターゲットのmRNAを選択的にプライミングします。このタイプのプライマーは、診断において用いられ、優れた評価を得ています。

テンプレートRNAの調製

RT-PCRの成功には、高品質の完全なRNAテンプレートが必要です。こうしたテンプレートの調製には以下のガイドラインを利用してください。

細胞溶解中に放出されるRNase活性を最小限にするには、懸濁液にプロテクターRNaseインヒビターを含めるか、細胞を破壊すると同時にRNaseを不活化させます。
ガラス器具、プラスチック器具、試薬などからのRNaseコンタミネーション源をすべて除去するための措置を講じてください。
Rocheの核酸調製用製品など、テンプレートRNAを調製するための核酸精製に特化して設計された製品を用いてください。
テンプレートには全RNAではなく精製mRNAを使用します。ポリ（A）+ mRNAで開始すると、存在量の少ないmRNAの増幅成功率が大幅に向上します。これは、全RNA調製物におけるmRNAの比率がきわめて低いためです（一般に、哺乳類細胞由来の全RNAの1～5%）。
mRNAをテンプレートとして用いる場合は、RT-PCRで用いる前にゲル電気泳動によりmRNAの完全性を確認してください。mRNAは500 bp～8 kbの間にスメアとなって現れます。その大部分は1.5～2 kbに見られます。

プライマー設計

特定のmRNA配列のRT-PCR増幅には、そのmRNA配列に特異的な2つのPCRプライマーが必要です。そのプライマー設計によって、cDNAの増幅産物と混入したゲノムDNA由来の増幅産物の識別も可能になります。必要なプライマーの設計には、2種類のアプローチがあります（図2）。

図2.プライマー設計アプローチ

パネル1：イントロンの両側にあるエクソンの配列にアニールするプライマーを作成します。これらのプライマーにより、ゲノムDNAから増幅される産物はすべて、イントロンのないmRNAから増幅される産物よりもはるかに大きくなります。
パネル2：mRNA上のエクソン／エクソンジャンクションをまたぐプライマーを作成します。そうしたプライマーはゲノムDNAを増幅しないと考えられます。

RT-PCRの手順

RT-PCRは1ステップまたは2ステップの手順で実行でき、両者にそれぞれの利点があります。

1.2ステップ手順

A. 2チューブ・2ステップ手順

最初のチューブでは、ランダムヘキサマー、オリゴ（dT）プライマー（cDNAプールを生成）、または配列特異的プライマーのいずれかを使用して、最適な条件下で第一鎖cDNAの合成が実施されます。次に、RT反応液のアリコートをPCR用の別のチューブ（熱安定性DNAポリメラーゼ、DNAポリメラーゼバッファー、およびPCRプライマーを含む）に移します。

このアプローチには次のような利点があります。この方法は、同じRT反応液からの複数の転写産物を分析する必要がある実験や、DDRT（Differential Display Reverse Transcription）法やRACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）法などの特定の用途で役立ちます。また、RT反応は最適な条件下で行われるため、このアプローチでは最長のRT-PCR産物が生成されます（適切な酵素を使用した場合の最大長は14 kb）。

A. 1チューブ・2ステップ手順

最初のステップでは、逆転写酵素によって、Mg²⁺イオン、高濃度dNTP、および特異的または非特異的［オリゴ（dT）］プライマー（反応容量、20 µL）の存在下で第一鎖cDNAが生成されます。RT反応に続いて、最適化されたPCRバッファー（Mg²⁺イオンなし）、熱安定性DNAポリメラーゼ、および特異的プライマーがチューブに添加され、PCRが実施されます。このアプローチは、RT反応液全体が後続のPCRで使用されるため、テンプレートの量が制限されている場合に役立ちます。

2ステップ手順には次のような利点があります。

反応条件を最適化。2ステップ形式により、逆転写とPCRの両方を最適な条件下で実施できるため、増幅の効率性と精度が保証されます。
フレキシビリティー。2ステップ手順により、単一のcDNA合成反応の産物を複数の転写産物の分析に使用できます。この柔軟性は、RACE法やDDRT法などの特殊な用途に役立ちます。
長い配列を増幅。逆転写酵素と耐熱性DNAポリメラーゼを適切に組み合わせることにより、2ステップRT-PCRでは、最大で長さ14 kbのRNA配列を増幅することが可能です。

2.1チューブ・1ステップ手順（組み合わせRT-PCR）

cDNA合成とPCR増幅の両方が同じバッファーと部位特異的プライマーを使用して実施されるため、RTステップとPCRステップの間の反応チューブを開く必要がありません。1ステップアプローチは、（上記の1チューブ・2ステップ手順の反応のように）感度が高いことに加えて、最小限のピペット操作でチューブを開かずに反応全体が実施されるため、コンタミネーションの可能性を最小限に抑えることができます。また、両方のステップで使用されるプライマーが配列特異的であるため、特定の転写産物を直接分析することが可能になります。さらに、この手順で使用される熱活性逆転写酵素は、高いRT反応温度（50〜72 ℃）を可能にします。これにより、ミスプライミングが減り、二次mRNA構造が排除されることで反応の特異性が高まります。

1ステップ手順には次のような利点があります。

所要時間を最小化。1ステップ反応は2ステップ反応よりもピペット操作が少なくて済むため、RT-PCRの実施に要する時間が大幅に短縮され、ピペッティングエラーが排除されます。
コンタミネーションリスクを軽減。1ステップ反応全体が単一のチューブで行われるため、転写や反応チューブの開栓といった、PCRサンプルのコンタミネーションが発生する可能性のあるステップが不要になります。
cDNA合成の感度と特異性の向上。1ステップ反応の次の2つの特性により、収量と効率が向上します。（1）cDNA反応は高温で行われます（RNAの二次構造の問題を排除するため）。（2）cDNAサンプル全体がPCRのテンプレートとして使用されます。

キャリーオーバーコンタミネーションの防止

ウラシルDNAグリコシラーゼによるキャリーオーバーコンタミネーションの防止

PCR反応は1個の分子を10億倍にも増幅できます。このため、ごく微量の夾雑物でも増幅され、偽陽性の結果となる恐れがあります。そのような夾雑物はしばしば、それ以前にPCR増幅した産物に由来します（キャリーオーバーコンタミネーション）。したがって、研究者は、そうしたコンタミネーションを回避するための手法を開発してきました。

一般的な手法としては、PCR増幅時にdTTPをdUTPに置き換え、ウラシル含有DNA（U-DNA）を作成することが挙げられます。その後のPCR反応液を増幅する前に、ウラシルDNAグリコシラーゼ（UNG）で処理しておきます。初期変性ステップ中に、アルカリ条件かつ高温（95℃）でピリミジン塩基のないポリヌクレオチドを切断することによって、汚染したU-DNAをサンプルから除去できます（図3）。この手法を用いる場合は、実験室におけるすべてのPCR反応を、dTTPではなくdUTPで実施する必要があります。

図3.ウラシル-DNAグリコシラーゼによる汚染したU-DNAの除去

ダウンストリームアプリケーションにおいてdU含有PCR産物を用いる場合は、以下の点に留意してください。

dU含有PCR産物は、ハイブリダイゼーションターゲットまたはジデオキシシークエンシングのテンプレートとして用いる場合、dT含有PCR産物と同様に機能します。
dU含有PCR産物は、UNG-細菌宿主に形質転換される場合、直接クローニングできます。
dU含有基質は一部の一般的な制限酵素（例：Eco RIおよびBam HI）により容易に消化されます。これに対し、別の酵素（例：Hpa I、Hind II、Hind III）は同基質に対する活性が低下します。
dU含有DNAは、タンパク質結合研究またはDNA-タンパク質相互作用研究用途には適していません。

RT-PCRにおけるキャリーオーバーコンタミネーションの防止

RNAの増幅時にキャリーオーバーコンタミネーションを防止する方法は2つあります。

1チューブ・1ステップのRT-PCR手順によって、ピペット操作のステップ数と反応チューブの開栓回数を最小限に抑えます。これにより、RT-PCR自体におけるキャリーオーバーコンタミネーションの危険性を最小化できます。
dUTPの存在下で1ステップRT-PCRを実施し、すべての産物にdUが含まれ、その後のUNGを用いたPCRにより除去できるように処置します（「ウラシルDNAグリコシラーゼによるキャリーオーバーコンタミネーションの防止」を参照）。これにより、その後のPCRにおけるキャリーオーバーコンタミネーションが防止されます。

トラブルシューティング

ここでは、これまでに確認されている5つの最も一般的な症状に基づいて、PCRに関して収集したトラブルシューティングのヒントをいくつか示します。トラブルシューティングを開始する前に、他の応用上のヒントに目を通しておいてください。

PCR産物が生じない場合

PCR産物が生じない場合のトラブルシューティングのヒントは次のとおりです。

1.Mg²⁺の濃度が最適でない

推奨される対策：PCR最適化キットを使用して、マグネシウム濃度を調整します。

2.反応液中のテンプレートの量が最適でない

テンプレートの必要量は反応液ごとに異なります。ガイドラインとして、反応液100 µLあたり100〜750 ngのヒトDNA（10⁵〜10⁶コピー）が使用されます。酵素の量は、テンプレートごとに最適化する必要があります。

推奨される対策：

反応液中のテンプレートの量を調整します。
推奨範囲（0.5〜5.0 U）で酵素濃度を0.50 U刻みで変化させて最適化実験を行います。

3.反応液中に酵素の阻害物質が含まれている

PCR酵素の阻害物質としては下記の物質が知られています。

50 mM塩化アンモニウム
EDTA（金属キレーター）
>0.8 µMヘマチン
PBS（リン酸塩が遊離マグネシウムに結合するため）
>0.02% サルコシル
0.5 M尿素
>5% DMF
>10% ホルムアミド
ヘパリン
>20% PEGデオキシコール酸塩
>0.01% SDS（NP40とTween® 20の等モル比で転化が可能）
>10% DMSO
>20% グリセロール
>0.4% n-オクチルグルコシド
残留フェノール
>0.06% デオキシコール酸ナトリウム
ピロリン酸塩

推奨される対策：反応ミックス内の阻害物質の濃度を下げるか、阻害物質を取り除きます。

4.プライマーアニーリング温度が高すぎる、または低すぎる

一般的に、プライマーアニーリング温度は50〜60℃です（プライマー配列とバッファー成分に基づいて、これより高くなることも低くなることもあります）。

推奨される対策：次の式に基づいてTm／アニーリング温度を決定します。

プライマーが20～35塩基の場合
Tp = 22 + 1.46 （Ln）
Ln = 2（# GまたはC） + （# AまたはT）
Tp = 有効アニーリング温度 ± 2～5

プライマーが14～70塩基の場合
Tm = 81.5 + 16.6 （log10 [J+]） + 0.41 （% G + C） - （600/l） - 0.063 （ホルムアミドの濃度%） + 3～12
[J+] = 1価陽イオンの濃度
l = オリゴヌクレオチドの長さ

5.プライマーが分解されているか、最適ではない

プライマーのG+Cの数がA+Tの数に対して同等であり、特異性のために14塩基以上であることが必要です。

推奨される対策：

プライマーが短いか、A-Tが多い場合は、0.9～2.0%（v/v）のDMSOを添加します。
G-Cが多い場合は、1～10%（v/v）のホルムアミドを添加します。
プライマーの配列を再確認し、可能な場合はプライマー設定を使用します。
ゲル上のプライマーをアリコートに小分けして、分解されていないことを確認します。

6.テンプレート変性が不完全

変性ステップ中の加熱が不十分であることは、PCR反応が失敗するよくある原因の1つです。完全な鎖分離が起こる温度に反応液が達することが非常に重要です。ほとんどの場合、約94℃の温度で2分間加熱すれば十分です。

サンプルが94℃に達した後すぐに、アニーリング温度まで冷却できます。大規模な変性はおそらく不要であり、高温にさらされる時間を制限することで、反応全体を通してポリメラーゼ活性を最大に保つことが可能になります。

Mg濃度の高い（4〜5 mM）DNA反応バッファーでは、DNAテンプレート鎖の完全な分離を可能にするために、高い変性温度が必要となる場合があります。マグネシウムを添加せずに、付属のバッファーを使用することをお勧めします。

推奨される対策：

最初の変性温度を95～97 ℃に上げます。
DNAから酵素とバッファーを除いたものを4〜6分間変性させます。
サイクリング変性時間を15〜30秒増やします。
ホットスタート法を試してみます。
閉環状DNAは、PCRの前に切断しておく必要があります。切断されていない環状DNAでは、再生が速すぎます。

7.PCR装置のエラー

推奨される対策：

加熱ブロックを較正し、実際のブロック温度を確認します。
特定の装置の診断プログラムを実行します。詳細については、装置の製造元にお問い合わせください。

8.テンプレートの二次構造によるミスプライミング、再生、またはプライマーの3´末端における過剰な相同性

推奨される対策：

最初の変性温度を95～97 ℃に上げます。
DNAから酵素とバッファーを除いたものを4〜6分間変性させます。
サイクリング変性時間を15〜30秒増やします。
ホットスタート法を試してみます。
T4 Gene 32タンパク質3～5 µL/mLを添加します。
プライマーの3´末端で相同性が2塩基を超えないように設計します。可能な場合はプライマー設計プログラムを使用します。
反応バッファーに下記の補助溶剤を添加することを検討します。
- 3～15% DMSO
- 1～10% ホルムアミド
- 5～15% ポリエチレングリコール
- 10～15% グリセロール

9.NaClの濃度が50 mMを超えている

推奨される対策：NaClの濃度を下げます。

10.KCIの濃度が50 mMを超えている

推奨される対策：KClの濃度を下げます。

誤取り込みや低精度などのエラーが多い場合

PCR反応で誤取り込みや低精度などのエラーが多い場合のトラブルシューティングのヒントは次のとおりです。

1.Mg²⁺の濃度が最適でない

推奨される対策：PCR最適化キットを使用して、マグネシウム濃度を調整します。

2.ヌクレオチドの濃度が高すぎるか、バランスが取れていない

各ヌクレオチドの標準的な濃度は20〜200 µMです。

推奨される対策：

各ヌクレオチドの保存溶液の濃度を確認します。
各ヌクレオチドの最終濃度を再確認します。

3.反応バッファーのpHが高すぎる

最適なpHは8.3です。

推奨される対策：

反応バッファーのpHは5〜6まで下げることができます。
塩基置換の変化が60分の1に減少し、フレームシフトの変化が3単位のpHの低下によって11分の1に減少します。

4.テンプレートの二次構造によるミスプライミング、再生、またはプライマーの3´末端における過剰な相同性

推奨される対策：

最初の変性温度を95～97 ℃に上げます。
DNAから酵素とバッファーを除いたものを4〜6分間変性させます。
サイクリング変性時間を15〜30秒増やします。
ホットスタート法を試してみます。
T4 Gene 32タンパク質3～5 µL/mLを添加します。
プライマーの3´末端で相同性が2塩基を超えないように設計します。可能な場合はプライマー設計プログラムを使用します。
反応バッファーに下記の補助溶剤を添加することを検討します。
- 3～15% DMSO
- 1～10% ホルムアミド
- 5～15% ポリエチレングリコール
- 10～15% グリセロール

5.テンプレートDNAが損傷している

推奨される対策：

高pHで繰り返し加熱／冷却するとテンプレートが損傷する可能性があるため、サイクル数を最小限に抑えます（大半のテンプレートで25〜35サイクルが必要です）。
テンプレートDNAの完全性を確認します。
サイクリング変性時間を15〜30秒に短縮します。

非特異的なバンドがある

PCR反応後の非特異的なバンドが多い場合のトラブルシューティングのヒントは次のとおりです。

1.Mg²⁺の濃度が最適でない

推奨される対策：PCR最適化キットを使用して、マグネシウム濃度を調整します。

2.ヌクレオチドの濃度が高すぎるか、バランスが取れていない

各ヌクレオチドの標準的な濃度は20〜200 µMです。

推奨される対策：

各ヌクレオチドの保存溶液の濃度を確認します。
各ヌクレオチドの最終濃度を再確認します。

3.DNAのコンタミネーション／キャリーオーバー

推奨される対策：

ターゲットDNAを添加せずにPCRを実施して、キャリーオーバーをテストします。
キャリーオーバーを防ぎます（下記を参照）。

キャリーオーバーを防ぐには、適切な実験室管理を行ってください。以下の優良試験所基準に従います。

PCRの精製物と産物を物理的に分けます
溶液、チップ、チューブをオートクレーブ滅菌します
反復的なサンプリングを最小限に抑えるため、試薬をアリコートに小分けしておきます（1アリコートあたり20反応以下）
容積式ピペットを使用してエアロゾルを排除します
試薬を使用前に混合します
DNAを反応液に最後に添加します
ポジティブコントロールとネガティブコントロールを慎重に選択します
DNAを脱プリン化するためにゲルボックスとコームを1 M HClに浸します
バンドの切除には新しいかみそりの刃を使用します
UVボックスを新しいラップで覆います
オイルによる反応液保護を必ず行います

コンタミネーション／キャリーオーバーを排除するには、以下を実行します。

紫外線照射：テンプレートDNAを除くすべての成分を混合します。ガラス製トランスイルミネーター（254および300 nm UV電球）と直接接触している透明な0.5 mLポリプロピレンチューブで5分間照射します。
UNG消化：dUTPヌクレオチドを反応液に組み込み、その後ウラシルDNAグリコシラーゼ消化を行います。

4.プライマーアニーリング温度が低すぎる

推奨される対策：次の式に基づいてTm／アニーリング温度を決定します。

プライマーが20～35塩基の場合
Tp = 22 + 1.46 （Ln）
Ln = 2（# GまたはC） + （# AまたはT）
Tp = 有効アニーリング温度 ± 2～5

5.テンプレートの二次構造によるミスプライミング、再生、またはプライマーの3´末端における過剰な相同性

推奨される対策：

最初の変性温度を95～97 ℃に上げます。
DNAから酵素とバッファーを除いたものを4〜6分間変性させます。
サイクリング変性時間を15〜30秒増やします。
ホットスタート法を試してみます。
T4 Gene 32タンパク質3～5 µL/mLを添加します。
プライマーの3´末端で相同性が2塩基を超えないように設計します。可能な場合はプライマー設計プログラムを使用します。
反応バッファーに下記の補助溶剤を添加することを検討します。
- 3～15% DMSO
- 1～10% ホルムアミド
- 5～15% ポリエチレングリコール
- 10～15% グリセロール

6.プライマーが分解されているか、最適ではない

プライマーのG+Cの数がA+Tの数に対して同等であり、特異性のために14塩基以上であることが必要です。

推奨される対策：

プライマーが短いか、A-Tが多い場合は、0.9～2.0%（v/v）のDMSOを添加します。
G-Cが多い場合は、1～10%（v/v）のホルムアミドを添加します。
プライマーの配列を再確認し、可能な場合はプライマー設定を使用します。
ゲル上のプライマーをアリコートに小分けして、分解されていないことを確認します。

7.プライマー濃度が高すぎる

推奨される対策：プライマー濃度を調整します（各プライマーの0.1～1.0 µMが最適です）。

8.サイクル数が多すぎる

ほとんどのテンプレートで25～30サイクルが必要です。

推奨される対策：サイクル数は、テンプレートDNAの開始濃度に基づいて決定する必要があります。

サンプル内のターゲット分子の数	推奨されるサイクル数
3 x 10⁵	25～30
1.5 x 10⁴	30～35
1.0 x 10³	35～40
50	40～45

9.テンプレートと酵素の比率が正しくない

推奨される対策：

反応液中のテンプレートの量を調整します。
推奨範囲（0.5〜5.0 U）で酵素濃度を0.50 U刻みで変化させて最適化実験を行います。

バンドがスメアーになる場合

PCR反応後にバンドがスメアーになる場合のトラブルシューティングのヒントは次のとおりです。

1.Mg²⁺の濃度が最適でない

推奨される対策：私たちのPCR最適化キットを使用して、マグネシウム濃度を調整します。

2.ヌクレオチドの濃度が高すぎるか、バランスが取れていない

各ヌクレオチドの標準的な濃度は20〜200 µMです。

推奨される対策：

各ヌクレオチドの保存溶液の濃度を確認します。
各ヌクレオチドの最終濃度を再確認します。

3.DNAのコンタミネーション／キャリーオーバー

推奨される対策：

ターゲットDNAを添加せずにPCRを実施して、キャリーオーバーをテストします。
キャリーオーバーを防ぎます（下記を参照）。

キャリーオーバーを防ぐには、適切な実験室管理を行ってください。以下の優良試験所基準に従います。

PCRの精製物と産物を物理的に分けます
溶液、チップ、チューブをオートクレーブ滅菌します
反復的なサンプリングを最小限に抑えるため、試薬をアリコートに小分けしておきます（1アリコートあたり20反応以下）
容積式ピペットを使用してエアロゾルを排除します
試薬を使用前に混合します
DNAを反応液に最後に添加します
ポジティブコントロールとネガティブコントロールを慎重に選択します
DNAを脱プリン化するためにゲルボックスとコームを1 M HClに浸します
バンドの切除には新しいかみそりの刃を使用します
UVボックスを新しいラップで覆います
オイルによる反応液保護を必ず行います

コンタミネーション／キャリーオーバーを排除するには、以下を実行します。

紫外線照射：テンプレートDNAを除くすべての成分を混合します。ガラス製トランスイルミネーター（254および300 nm UV電球）と直接接触している透明な0.5 mLポリプロピレンチューブで5分間照射します。
UNG消化：dUTPヌクレオチドを反応液に組み込み、その後ウラシルDNAグリコシラーゼ消化を行います。

4.プライマーアニーリング温度が低すぎる

推奨される対策：次の式に基づいてTm／アニーリング温度を決定します。

プライマーが20～35塩基の場合
Tp = 22 + 1.46 （Ln）
Ln = 2（# GまたはC） + （# AまたはT）
Tp = 有効アニーリング温度 ± 2～5

5.テンプレートの二次構造によるミスプライミング、再生、またはプライマーの3´末端における過剰な相同性

推奨される対策：

最初の変性温度を95～97 ℃に上げます。
DNAから酵素とバッファーを除いたものを4〜6分間変性させます。
サイクリング変性時間を15〜30秒増やします。
ホットスタート法を試してみます。
T4 Gene 32タンパク質3～5 µL/mLを添加します。
プライマーの3´末端で相同性が2塩基を超えないように設計します。可能な場合はプライマー設計プログラムを使用します。
反応バッファーに下記の補助溶剤を添加することを検討します。
- 3～15% DMSO
- 1～10% ホルムアミド
- 5～15% ポリエチレングリコール
- 10～15% グリセロール

6.DNase活性（予想されるバンドサイズを下回るゲルでスメアーが認められる）

推奨される対策：

新しい保存溶液を調整します。
テンプレートDNAの完全性を確認します。

7.ゲルサンプルが油で汚染されている

推奨される対策：反応チューブを回転させて、表面から油層を慎重に抽出します。

8.テンプレートと酵素の比率が正しくない

推奨される対策：

反応液中のテンプレートの量を調整します。
推奨範囲（0.5〜5.0 U）で酵素濃度を0.50 U刻みで変化させて最適化実験を行います。

収量が少ない場合

PCR反応後の収量が少ない場合のトラブルシューティングのヒントは次のとおりです。

1.プライマーアニーリング温度が高すぎる

推奨される対策：次の式に基づいてTm／アニーリング温度を決定します。

プライマーが20～35塩基の場合
Tp = 22 + 1.46 （Ln）
Ln = 2（# GまたはC） + （# AまたはT）
Tp = 有効アニーリング温度 ± 2～5

2.テンプレートがきれいではないか、分解されている

たとえば、ポリメラーゼはプロテアーゼ汚染によって分解される可能性があります。

推奨される対策：

ホットスタート法を試してみます。
プロテイナーゼKの消化を含め、DNAテンプレートを可能な限り精製します。

3.反応液中に酵素の阻害物質が含まれている

PCR酵素の阻害物質としては下記の物質が知られています。

50 mM塩化アンモニウム
EDTA（金属キレーター）
>0.8 µMヘマチン
PBS（リン酸塩が遊離マグネシウムに結合するため）
>0.02% サルコシル
0.5 M尿素
>5% DMF
>10% ホルムアミド
ヘパリン
>20% PEGデオキシコール酸塩
>0.01% SDS（NP40とTween® 20の等モル比で転化が可能）
>10% DMSO
>20% グリセロール
>0.4% n-オクチルグルコシド
残留フェノール
>0.06% デオキシコール酸ナトリウム
ピロリン酸塩

推奨される対策：反応ミックス内の阻害物質の濃度を下げるか、阻害物質を取り除きます。

4.反応液のテンプレートが足りない

推奨される対策：

反応液中のテンプレートの量を調整します。
推奨範囲（0.5〜5.0 U）で酵素濃度を0.50 U刻みで変化させて最適化実験を行います。

5.伸長温度が高すぎる

最適な伸長温度と伸長時間はフラグメントのサイズによって次のように異なります。

72 ℃で20秒間：フラグメントのサイズが500 bp未満の場合
72 ℃で40秒間：フラグメントのサイズが1.2 bpの場合

推奨される対策：長い領域を伸長する場合や二次構造の存在が考えられる場合は、伸長温度は変えず、伸長時間を延ばします。

6.酵素の活性が低い

Roche製のポリメラーゼの場合は、コントロール日まで100%の活性が保証されています。

推奨される対策：

コントロール日を確認します。必要な場合は、新しい酵素を入手します。
ホットスタート法でサーマルサイクリングによる活性維持を試みます。

7.サイクル数が多すぎる

ほとんどのテンプレートで25～30サイクルが必要です。

推奨される対策：サイクル数は、テンプレートDNAの開始濃度に基づいて決定する必要があります。

サンプル内のターゲット分子の数	推奨されるサイクル数
3 x 10⁵	25～30
1.5 x 10⁴	30～35
1.0 x 10³	35～40
50	40～45

8.ヌクレオチドが加水分解されている

ヌクレオチド保存溶液は常に10 mM以上の濃度で保管してください。最適濃度は100 mMです。1 mMで2ヵ月間保管すると、著しい加水分解が起こります。

NTPまたはdNTPを1 0mMの予想濃度で水に溶かします。0.05 Mにトリス塩基とpH試験紙を使用して、pHを7.0に調整します。中和されたNTPまたはdNTPをアリコートに小分けして適切に希釈し、次の表に示す波長での光学密度を計測します。吸光係数の値を使用して実際の濃度を計算します。アリコートに小分けして－20 ℃で凍結します。

塩基	波長	塩基eの吸光係数（M^-1 cm^-1）
A	259	1.54 x 10⁴
T	260	7.4 x 10³
G	253	1.37 x 10⁴
C	271	9.1 x 10³
U	262	1.0 x 10⁴

リチウム塩とナトリウム塩は同等の安定性を有し、PCR、配列決定、標識などの用途で同等に機能します。エタノールに対する溶解性は、リチウム塩がナトリウム塩を上回るため、エタノール沈殿によるリチウム塩の除去は、ナトリウム塩の除去よりも効率的です。リチウム塩ヌクレオチド調製物を使用すると、塩誘導性アーチファクトが減少し、シーケンスゲルの判読性が向上します。

9.ヌクレオチドの濃度が高すぎるか、バランスが取れていない

各ヌクレオチドの標準的な濃度は20〜200 µMです。

推奨される対策：

各ヌクレオチドの保存溶液の濃度を確認します。
各ヌクレオチドの最終濃度を再確認します。

10.プライマー濃度が低すぎる

推奨される対策：プライマー濃度を調整します（各プライマーの0.1～1.0 µMが最適です）。

11.PCR装置のエラー

推奨される対策：

加熱ブロックを較正し、実際のブロック温度を確認します。
特定の装置の診断プログラムを実行します。詳細については、装置の製造元にお問い合わせください。

12.プラトー効果

プラトー効果の考え得る原因と解決策は次のとおりです。

dNTPの使用 - dNTP濃度はそれぞれ20～200 µMであることが必要です。
最終産物のピロリン酸阻害 - ピロリン酸塩の形成を減らすため、サイクル数を20〜35に減らします。
高濃度での産物の不完全な変性 - 段階的なサイクリングを使用して、後発サイクルで変性時間を増やします。
基質／酵素比の基質過剰 - 段階的なサイクリングを使用して、後発サイクルでの伸長時間または酵素濃度を増やします。

13.蒸発

蒸発は成分の高濃度化につながり、酵素活性を阻害する可能性があります。体積の変化も、反応チューブ内の熱特性の変化につながります。

推奨される対策：100 µlのミネラルオイル重層／反応液を使用します。

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