ホームポリメラーゼ連鎖反応のアプリケーション5'/3' RACEキット、第2世代のトラブルシューティング

5'/3' RACEキット、第2世代のトラブルシューティング

cDNA末端迅速増幅（RACE）は、部分的に既知の配列から速やかに全長cDNAを得るために使用します。5'/3' RACEキット（製品番号03353621001）には、transcriptor逆転写酵素および組換え末端転移酵素が含まれています。transcriptor 逆転写酵素は5'/3' cDNAフラグメントの高感度で迅速な最大14 kbまでの増幅のために全長cDNAを転写します。組換え末端転移酵素は、ホモポリマーのAテールをcDNAの3'末端に付加するために使用します。ポリ(A)⁺テールは、オリゴ(dT)-アンカープライマーによる不適切な切断の可能性を低減させ、Ｇ-Ｃハイブリダイゼーションに比べてA-Tハイブリダイゼーションが弱いという問題を克服します。

cDNA末端迅速増幅法（RACE）のトラブルシューティング

結果が良くない場合

製品マニュアルに記載されている問題に加えて、末端転移酵素によるテーリング反応の効率が低下する場合があります。この問題はいくつかの理由で発生することが考えられます（一般に、コントロール反応および5' RACEに影響します）。

不適切な変性ステップ
テーリング反応前の変性ステップが、プロトコル通りに「+94 ℃で3分間インキュベートし、氷上で冷却する」で実施されたかどうかを確認します。

インキュベーション時間が不十分
テーリング反応のインキュベーション時間は30分に増やすことができます。

High Pure PCR Product Purification Kit の保存法が不適切
この場合、結合バッファー内で沈殿が生じることがあります。緩衝液成分のそのような沈殿物が最終溶出液に混入すると、その後の末端転移酵素反応を阻害する可能性があります。

cDNA精製プロトコル
5'/3' RACEの製品マニュアルに記載されている精製プロトコルに厳密に従ってください。
特に、最後の洗浄ステップ後（溶出前）の遠心分離ステップは、最高速度13,000 x gで少なくとも2分間実行することが重要です。結合したcDNAを溶出する前に、フィルターチューブを完全に乾かしてください。これにより、残留したエタノールによるテーリング反応の阻害を防ぐことができます。その他の遠心分離ステップは、すべて6,000〜8,000 x gで実行する必要があり、この場合は、30秒実行すれば十分です。

5'領域に60～100個のT塩基の伸長反応が見られる

5'-RACEの最終PCR産物を配列決定すると、60～100個のT塩基の伸長反応が5'領域で検出されることがあります。通常は、PCRアンカープライマーの3'末端に非T塩基が存在すると、プライマーがポリ(A)テールの内側の端に強制的に結合されるため、伸長反応は防げます。
それにもかかわらず、T塩基の伸長反応はいくつかの理由で生じる場合があります。

最初のPCRのアニーリング条件が最適でない場合（つまり、オリゴ-d(T)-アンカープライマーが完全にアニーリングしておらず、5'ポリ(A)テール内で結合しているような場合）に、校正機能のあるポリメラーゼ（Expand High Fidelity PCR SystemやExpand Long Template PCR Systemなど）をTaq DNAポリメラーゼの代わりに使用すると、アニーリングされていない3'非Tアンカー塩基が3'->5'エキソヌクレアーゼ活性によって除去される可能性があります。これにより、ポリAテール内からPCRのプライミングが行われ、長い5' T伸長反応がPCR産物内で生じる可能性があります。この反応を成功させるためには、アニーリング条件を厳格にすることが非常に重要です。
取り込まれなかった残留ヌクレオチドを除去するには、1stストランドcDNAを正しく精製することが非常に重要です。そうしないと、5'テール反応でA以外のヌクレオチドが組み込まれ、オリゴ-d(T)-アンカープライマーが5'ポリ（A）テールに内部結合する可能性があります。