一般的なshRNA　よくあるお問い合わせ（FAQ）

shRNAとは？

shRNAは、レンチウイルスコンストラクトのLTR領域内の短いヘアピン配列です。LTR間の領域が宿主ゲノムに組み込まれると、細胞によってshRNAが産生されて細胞質の中に移動し、酵素複合体のDicerによって切断されます。この切断が完了すると、この二本鎖分子のいずれかの鎖がRISC（RNA誘導型サイレンシング複合体）にロードされ、相補mRNAターゲットを見つけて分解しようとします。

クローンを用いればノックダウンは保証されますか？

標的遺伝子用shRNAの詳細ページに記載されているクローンセット数（製品によって異なりますが通常は5クローンです）を購入した場合、1遺伝子につき1クローン以上について70%超のノックダウンレベルを保証します。

どのような遺伝子ファミリーセットを提供していますか？

現在、大腸菌グリセロールストックの納品形態で提供しています。
現在、レンチウイルス粒子（パーティクル）の納品形態で提供しています。
私たちは、遺伝子パネル製品群を更新し続けています。これらは、グリセロールまたはレンチウイルスの納品形態で提供されています。別のセットが数カ月後に発売される予定です。目的の遺伝子セットがまだ販売されていない場合は、高度なカスタム調製についてお問い合わせください。私たちは、カスタム遺伝子セットをいつでも作成することができます。

3' UTR領域が標的のクローンが必ず存在するのはなぜですか？

ターゲットの3' UTRを標的とするクローンが含まれていれば、ターゲットに応じたcDNAクローンの導入によりノックダウン表現型を救済できる可能性があります。外因性のcDNAクローンからの転写物は、内因性複写物と比較してサイレンシングに影響を受けないと考えられています。観察された表現型を検証するために、多くの論文／審査委員会がこのような実験を要求しています。ただし、ほとんどのターゲットセットがこの追加機能を備えていても、すべてのターゲットセットが3' UTRクローンを含んでいるとは限りません。

TRCの「shRNAヘアピン配列のページ」で自前のshRNAを検索して設計できますか？

MISSION^™ TRCクローンライブラリーを設計するために使用するアルゴリズムは、TRCのページで確認されるものとほぼ同じです。ただし、ライブラリーはBroad-TRCによってクローニングされているため、設計には数多くの改良が加えられています。TRCのページで公開されているクローンは、最新の設計バージョンではありません。更新済みのターゲットセットを利用できるのは、TRCメンバーがメルクから購入した場合に限ります。

MISSION^™ TRC shRNAクローンは、クローニングの後にシーケンスされていますが、レトロウイルスベクターでは高頻度に組み換えが起こるため、一連の増幅の後に常にシーケンスを実施していますか？

複製の後に無作為でクローンのシーケンス確認を実施しています。シーケンスされるのは最後に複製が実施されたクローンの約5%です。私たちのR&Dグループは、組み換えの証拠を一切確認していません。TRCライブラリーは、これらの問題を防ぐように最適化されたバックボーンにクローニングされています。

カタログから入手可能な3タイプのRNAi、つまり大腸菌ストック、プラスミドDNA、およびレンチウイルス粒子のいずれかを研究プロジェクトのために選択しようとしています。プラスミドDNAの場合、入手したストックをPCRなどの手法を用いて増やす方法はありますか？また、サイレンシングされた遺伝子に関するデータを閲覧できる研究論文または文献へのリンクはありますか？

MISSION^™ TRC shRNAライブラリーは、柔軟性と利便性が得られるように3種類の納品形態で構成されています。精製プラスミドDNAの納品形態は、一過性のトランスフェクションアッセイに直接使用できます。またレンチウイルス粒子を産生するためにレンチウイルスパッケージングミックス（製品番号SHP001）とともに使用できます。プラスミドをコンピテントセル（GC5細胞を推奨）に形質転換して、大腸菌グリセロールストックを作成することにより、DNAをさらに増殖できます。

レンチウイルス粒子は最大の利便性をもたらします。これらは直接細胞に添加でき、安定した形質導入を得られます。お考えの通り、形質導入された細胞は統合されたshRNAを発現し続けます。この細胞は多くの下流アッセイに拡張できます。

shRNAクローンはどの納品形態で注文できますか？

複数（通常は約5種類）のshRNAクローンを、ヒトゲノム用とマウスゲノム用に提供しています。このライブラリーを使用して別の動物種に対応できることも多く、私たちのバイオインフォマティクスチームが一貫してお手伝いします。各ターゲットクローンは、大腸菌グリセロールストック、精製プラスミドDNA、レンチウイルス粒子の3種類の納品形態で提供しています。MISSION^™製品の注文に関する詳細はこちらをクリックしてください。

shRNAプラスミドのトランスフェクション用のプロトコルはありますか？

いいえ、ありません。お客様が現在ご使用のプラスミドDNAのトランスフェクションの方法を使用できます。現在、プラスミドDNAのトランスフェクションをしていない場合は、ESCORT^™ Vトランスフェクション試薬が推奨されます。

その他のプロトコルについては、プロトコルのページで確認できます。

TRC番号とは？

The RNAi Consortiumが策定した、TRCライブラリーを識別するための固有の番号です。TRC番号は「TRCN」で始まり、10桁の数字が続きます（例えば、MISSION^™ shRNA TRCN0000030720）。

この製品を使用するためにライセンスは必要ですか？

メルクからMISSION^™ TRC製品を研究目的で購入すると、Oxford BioMedicaの特許とBenitecの特許に対するラベルライセンスが譲渡されます。ただし、レンチウイルスshRNAベクターを別の供給元から入手する場合は、これらの特許に対するライセンスの購入が必要になります。私たちからライセンスを入手できるのは、研究用途のみに限られます。侵害防止に関する見解については、お客様の法務部門にご相談ください。

商用アプリケーションには別のライセンスの購入が必要ですか？

はい。商業用途の場合には、個別のライセンスについてOxfordBioMedicaおよびBenitecに問い合わせる必要があります。

グリセロール、DNAまたはウイルスのストックは何回凍結・解凍できますか?

DNAとグリセロールのストックは、過剰な凍結・解凍は避けるよう強くお勧めしますが、繰り返し凍結・解凍できます。ただし、レンチウイルスストックの凍結・解凍の繰返しは、ウイルスの機能性に大きく影響を及ぼすおそれがあります。最大限の生存率が今後の実験で得られるよう、初回の解凍後に分注することをお勧めします。

shRNAに適合する細胞バイオ／PCR製品はありますか？

タンパク質検出のための高品質なバリデーション済み抗体を提供しています。また、数多くのPCR関連製品もご用意しています。

shRNAのデリバリーにはどのような担体を使用していますか？

非ウィルスデリバリー：naked、ポリマー、および脂質ベースのデリバリー試薬。ウィルスデリバリー：レンチウイルス、レトロウイルス、およびアデノウイルス。

shRNAバリデーションはいつ完了しますか？

Broadとの連携により、毎月数千ものshRNAをバリデーションし、これらのデータを皆様の評価用としてウェブサイトに掲載しています。

どのようにshRNAをバリデーションしていますか？

SYBRグリーンqPCRを使用して、特定のshRNAの相対的なサイレンシング効果を測定しています。

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