医薬品におけるニトロソアミン類不純物試験に対するMillex^®シリンジフィルターの評価

• ニトロソアミン類不純物試験
  • 規制要件
  • 分析方法
  • サンプルろ過要件
• 実験方法
• ニトロソアミン類分析用フィルターの評価
  • 溶出物
  • 回収率
• ニトロソアミン類不純物試験とフィルター選択
• 関連製品
• 関連アプリケーション
• 参考文献

ニトロソアミン類不純物試験

医薬品中のニトロソアミン類の検出・定量は医薬品の安全性と品質を確保するうえで不可欠です。ニトロソアミンという化学的不純物は、複数かつ予測困難な経路で合成プロセスに導入され、発がん性や遺伝毒性を有するため患者の健康にリスクを生じることが疑われています^1-4。原薬や添加剤中に検出され、2018年以降、バルサルタンなど多数のリコールがありました^5,6。

ニトロソアミン類分析の規制要件

米国食品医薬品局（FDA）、欧州医薬品庁（EMA）、医薬品規制調和国際会議（ICH）などの医薬品の規制機関および組織は、医薬品中のニトロソアミン類に関するガイドラインや要件を提供しています。その重要なポイントの概要を表1に記載しています。

表1. 医薬品中のニトロソアミン類不純物に対応している医薬品規制機関および組織によるガイドラインおよび要件の抜粋。

機関名	ニトロソアミン類不純物に関するガイドライン
米国FDA7	APIおよび製剤の製造業者が医薬品中の許容できない濃度のニトロソアミン類不純物を検出し、防止するために講じるべき措置の推奨事項を示すガイダンスを提供。 製薬企業は、ニトロソアミン類不純物の潜在的発生源を特定し、リスクを評価し、汚染を防止するために適切な対策を講じることが期待されている。 質量分析法などの分析法および製剤中のニトロソアミン類の分析に適したその他技術を提案している。
EMA8	ヒト用医薬品中のニトロソアミン類不純物の防止、検出、リスク緩和に関するガイドラインおよび推奨事項を公表。 多様な薬剤クラスにおける特有のニトロソアミン類不純物の閾値および限度値を示している。 製造業者は、ニトロソアミン類不純物のリスク評価を実施し、試験を行い、あらゆる結果を規制当局に報告する必要がある。
カナダ保健省9	製造業者に、リスク評価の実施および適切な予防策の実行など、製品中のニトロソアミン類の存在を評価し、低減するよう求めている。
医薬品医療機器総合機構（PMDA） – 日本10	製剤中のニトロソアミン類不純物の検出および管理に関するガイドラインを発表。ガイドラインでは、管理および予防のためのリスク評価、試験法、戦略に関する推奨事項を示している。
健康科学庁（HSA） – シンガポール11	製剤の登録業者にニトロソアミン類不純物についてその製剤のリスク評価を実施するよう求めている。 医薬品中のニトロソアミン類不純物の特定および測定用の試験法を開発。
台湾FDA12	製造販売許可を有する業者に、製剤中のニトロソアミン類不純物を積極的に評価し、リスクを検討するよう通知。 ニトロソアミン類不純物試験に推奨される試験法を開発。
ICH4	ニトロソアミン類をクラス1の不純物、すなわち「既知の変異原性発がん物質」と分類。  M7ガイドラインを発表。潜在的な発がんリスクを制限するために医薬品中のDNA反応性（変異原性）不純物の評価および管理に重点を置いている。 世界中の規制当局および薬局方の既存の方法を調和させることを目的としている。

これらの規制当局は、ニトロソアミン類不純物に関するガイドラインを積極的に監視・更新し、公衆衛生と安全性を確保しています。医薬品製造業者はこれらのガイドラインおよび要件を遵守し、医薬品のニトロソアミン類による汚染リスクを評価および緩和することが重要です。

ニトロソアミン類分析用の分析方法

EMA、米国FDAなどの世界的規制機関は、医薬品におけるニトロソアミン類分析には頑健な分析手法が重要であることを強調しています。LC-MS/MSは、さまざまな規制機関で共通してニトロソアミン類分析に推奨される分析法です。高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）による分離とタンデム質量分析法による検出（MS/MS）を併用することによって、高い感度、選択性、精度が実現します。LC-MS/MSは、複雑なサンプルマトリックス中の微量の多様なニトロソアミン類の検出・定量が可能であり、日常的な分析と規制限度値の遵守に適しています。USP <1469> Procedure 3ではニトロソアミン類の定量にLC-MS/MSを使用しています¹³。米国FDA、欧州薬局方¹⁴、シンガポール健康科学庁（HSA）¹⁵、台湾FDA¹⁶も、ラニチジンおよびその他の医薬品中のニトロソアミン類測定用のLC-MS/MS法を発表しました。

HPLCと高分解能質量分析法（HPLC-HRMSまたはLC-HRMS）の併用は、ニトロソアミン類分析に用いられるもう1つの重要な技術です。この方法は選択性が高いためニトロソアミン様不純物を実際のニトロソアミン類と識別し、試験結果の信頼性が確保されます。FDAは、LC-HRMS法を開発・バリデーション済みであり¹⁷、USP <1469> Procedure 1でもこの方法を概説しています⁷。

HPLCとUV/Vis検出もニトロソアミン類分析に用いられます。LC-MS/MS法と比べて感度は低いと考えられますが、原材料、溶媒、添加剤の迅速分析法として活用できます。Agence Nationale de Sécurité du Médicament et des Produits de Santé（ANSM）には、HPLC-UVに基づく2つの手法があります^18,19。

ガスクロマトグラフィー－タンデム質量分析法（GC-MS/MS）は通常用いられるもう1つのニトロソアミン類分析方法です。本法はニトロソアミン検出感度と特異性に優れており、特に揮発性ニトロソアミン類に有用です。USP <1469>¹⁰ 、台湾FDA¹³およびスイス医薬品局²⁰はニトロソアミン類試験にGC-MS/MS法を使用しており、シンガポール健康科学庁（HSA）は、高分解能精密ガスクロマトグラフィー－質量分析法（HRAM-GCMS）²¹に基づく手法を発表しました。

ニトロソアミン類分析のためのサンプルろ過の要件

上述の手法の大半では、注入前にサンプルをろ過する必要があります。ろ過は注入前のサンプルおよび移動相中の粒子を除去する最も簡単な方法であり、これがHPLC装置の性能に多大な影響を及ぼす可能性があります。粒子は製剤の溶解プロセスで発生し、バルサルタンなどの製剤にきわめて高頻度に認められます。メンブレンフィルターの孔径等級は、サンプル中の粒子を保持できる程度を示し、HPLC法では0.45 µmが一般的です。より小さな粒子（例：2 µm未満の粒子）を充填したカラムを用いる場合およびUHPLCを使用する場合には、0.2 μmのフィルターが推奨されます。先行研究で示されているとおり、同じ孔径のメンブレンフィルターが常に同じ捕捉効率であるとは限らないことに注意することが重要です²²。

表2には、世界中の規制機関が発表した特定の方法におけるろ過ステップを一覧しています。ニトロソアミン類分析法では、シリンジフィルターが好まれるフォーマットです。関係のあるシリンジフィルターの重要な特性は、メンブレンフィルターの材質と孔径の2つです。PVDFおよびPTFEは発表されている分析法において最も一般的に使用されているメンブレンフィルターの材質です。一部の事例では、ナイロンおよび親水性ポリプロピレン（例：GHPメンブレン）も言及されています（表2）。これらの方法における孔径は0.2 μm、0.22 μm、0.45 μmです。

表2. 世界の規制機関が発表したニトロソアミン類不純物試験に用いる分析方法におけるろ過要件の抜粋。

機関	方法	ろ過
米国FDA	メトホルミン中のニトロソアミン類不純物の測定に用いるLC-ESI-HRMS法 原薬および製剤23	「0.22 µm PVDFシリンジフィルターを用いて 上清をろ過する」
	ARB剤中の6種類のニトロソアミン類不純物 の測定に用いるLC-HRMS法24	「0.22 µm PVDFシリンジフィルターを用いて 上清をろ過する」
USP10	<1469>ニトロソアミン類不純物
	Procedure 1	「孔径0.2 μmの適切なフィルターを通して溶液をろ過する」
	Procedure 3	「孔径0.45 μmの親水性ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）フィルターを用いて ろ過し、バイアルに入れる」
	Procedure 4	「…孔径0.45 µmのナイロンフィルター。サンプル抽出液1 mLをろ過する」
欧州薬局方	2.5.42。有効成分中のN-ニトロソアミン類
	Procedure A	「メンブレンフィルター（公称孔径0.20 µm）を通して 上清をろ過する」
	Procedure B サンプル調製2	「必要であれば、メンブレンフィルター（公称孔径0.45 µm）を通して上清をろ過する」
Agence Nationale de Sécurité du Médicament et des Produits de Santé（ANSM）	HPLC/UVによるサルタン原薬中のNDMAおよびNDEAの測定12	「孔径0.45 µmのGHPメンブレンを通してアリコート・・・をろ過する」
	HPLC/UVによるバルサルタン有効成分および最終製品中のNDMAの測定13	「孔径0.45 µmのPVDFメンブレンを通してアリコート・・・をろ過する」
シンガポール健康科学庁（HSA）	以下の測定に用いる（LC-MS/MSによる）試験法 ·   西洋医学の医薬品中の6種類のニトロソアミン類不純物25 ·   メトホルミンおよびラニチジン製剤中のN-ニトロソジメチルアミン（NDMA）26 ·   リファンピシン中の1-メチル-4-ニトロソピペラジン（MNP）27 ·   サルブタモール製剤中のN-ニトロソサルブタモール28	「メンブレンシリンジフィルター（PTFE 0.2 µm）」
	HRAM-GCMSによるメトホルミン製剤中のN-ニトロソジメチルアミン（NDMA）を測定するための試験法15	「メンブレンフィルター（PTFE 0.2 µm）」
台湾食品医薬品局	医薬品中のニトロソアミン類の試験法 - 複合分析（LC-MS/MS法）29	「メンブレンフィルター：0.22 μm、PVDF」
	医薬品中のニトロソアミン類の試験法 - 複合分析（GC-MS/MS法）30	「メンブレンフィルター：0.22 μm、PVDF」

実験方法

本試験では、バリデーション済みのUSP <1469> Procedure 3の方法を使用しました³¹。 Part 1は、シリンジフィルター装置のニトロソアミン類不純物溶出物に関する試験であり、Part 2はスパイク済みバルサルタンを用いた回収試験です。LC-MS/MSの条件を表3、MRM遷移を表4に示します。

表3. LC-MS/MS分析条件

装置：	Agilent 1290 Infinity II装置とAgilent 6495C三重極質量分析計
カラム：	Ascentis® Express C18カラム、2.7 µm、15 cm×2.3 mm
移動相：	［A］水＋0.1%ギ酸、［B］メタノール＋0.1%ギ酸
グラジエント：	Time (min)			A%	B%
			初期	97.0	3.0
			1.5	97.0	3.0
			4.0	50.0	50.0
			7.0	25.0	75.0
			8.1	15.0	85.0
			9.2	5.0	95.0
			12.0	5.0	95.0
			12.1	97.0	3.0
流量：	0.50 mL/min
圧力：	初期圧力：320 bar 最大圧力：460 bar
カラム温度：	60℃
検出器：	MS、APCI (+)、MRM（詳細は表4参照）
注入：	20 μL
サンプル：	本文を参照

表4. 6種類のニトロソアミン類不純物のMRM遷移

ピーク	略称	化合物名	MRM	衝突エネルギー（V）
1	NDMA	ニトロソジメチルアミン	75.1->43.3	16
2	NMBA	ニトロソメチルフェニルアミン	147.1->117.1	4
3	NDEA	ニトロソジエチルアミン	103.1->75.1	8
4	NEIPA	ニトロソエチルイソプロピルアミン	117.1->75.1	8
5	NDIPA	ニトロソジイソプロピルアミン	131.1->43.3	12
6	NDBA	ニトロソジブチルアミン	159.2->57.1	12

試験を行ったシリンジフィルター。（1）Millex^® PVDF 0.22 µmおよび（2）Millex^® PTFE 0.2 µmの2ロットからそれぞれ3個ずつ、（3）Supplier P PVDF 0.2 µm、（4）Supplier C H-PTFE 0.2 µm、（5）Supplier M PVDF 0.2 µm、（6）Supplier M PTFE 0.2 µmの1ロットからそれぞれ3個ずつのシリンジフィルターを試験しました。

パート1－溶出物。シリンジフィルターにおいてベースラインレベルのニトロソアミン類不純物溶出物が認められるかどうかを決定するため、 希釈液のみ（0.1% v/vギ酸溶液）をUSP <1469>に従ってアイソトープ標識内部標準（IS）でスパイクしました［NDMA-d₆およびNMBA-d₃では10 µg/mLならびにNDEA-d₁₀/NDBA-d₁₈では1 µg/mL］。サンプルをボルテックスで攪拌し、遠心分離して（10,000 rpm、10分）、上清を13 mmのシリンジフィルターでろ過しました。LC-MS/MSを用いてろ液中の6種類のニトロソアミン化合物を分析しました。1.33～90 ng/mL（NDMA、NMBA、NEIPA、NDIPA、NDBA）および0.66～69.4 ng/mL（NDEA）の外部較正曲線を用いて濃度を決定しました。

パート2－回収率。Valsartan dura（用量80 mg）40 mgをUSP <1469>に従って粉末状にし、1%ギ酸溶液で希釈して、低（L2）濃度でスパイクしました。次にサンプルを遠心分離してろ過した後に、LC-MS/MSで分析しました。 

ニトロソアミン類分析用フィルターの評価

多くのLC-MSおよびGC-MSを用いた試験法において、ニトロソアミン類不純物試験の一環としてサンプル注入前のサンプルのろ過を行います。ろ過装置に溶出物が認められないようにすることが、これらの方法のデータの精度や一貫性を維持する上で重要です。また、ある種の分子はシリンジフィルターの部品に結合し、作成されるデータの品質に影響を及ぼす可能性があるため、回収試験の実施も不可欠です。

USP <1469> Procedure 3に基づくバリデーション済みの方法を用いて、シリンジフィルターの評価を実施しました²⁷。このUSP法は、 選択されたサルタン類（バルサルタン、ロサルタンカリウム、オルメサルタン メドキソミル、カンデサルタン シレキセチル、テルミサルタン）中のNDMA、NDEA、NDIPA、NEIPA、NMBA、NDBAの定量に対するLC-MS/MSの使用について述べています。本法の「サンプル溶液」のサブセクションの最後のパートで「孔径0.45 μmの親水性ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）フィルターを使用した」ろ過が求められています¹¹。

パート1－溶出物

ニトロソアミン類溶出物について、シリンジろ過ステップのろ液を、1.33～90 ng/mL（NDMA、NMBA、NEIPA、NDIPA、NDBA）および0.66～69.4 ng/mL（NDEA）の外部較正曲線を用いて分析します。図1は、これらの化合物のMRMクロマトグラムの例です。

図1. ニトロソアミン標準物質溶液のMRMクロマトグラム（NDMA、NMBA、NEIPA、NDIPA、NDBAでは10 ng/mLおよびNDEAでは6.6 ng/mL）。

定量限度値（LOQ）は、S/N比が10である濃度と定義しています。分析した各ニトロソアミン類不純物の較正曲線の最低濃度は、S/Nが10を超えました。試験を行ったシリンジフィルターのいずれにおいてもこの値以上でニトロソアミン類は検出されませんでした（表5）。

表5. USP <1469> Procedure 3を用いたさまざまなシリンジフィルター装置中のニトロソアミン類溶出物分析<1469>の結果

化合物名	較正曲線上の最低濃度 (ng/mL)	S/N	定量下限値（LOQ）
			PVDFメンブレン搭載シリンジフィルター			PTFEメンブレン搭載シリンジフィルター
			Millex®シリンジフィルター	ベンダーP	ベンダーM	Millex®シリンジフィルター	ベンダーC	ベンダーM
NDMA	1.33	>10	<1.33	<1.33	<1.33	<1.33	<1.33	<1.33
NMBA	1.33	>10	<1.33	<1.33	<1.33	<1.33	<1.33	<1.33
NDEA	0.66	>10	<0.66	<0.66	<0.66	<0.66	<0.66	<0.66
NEIPA	1.33	>10	<1.33	<1.33	<1.33	<1.33	<1.33	<1.33
NDIPA	1.33	>10	<1.33	<1.33	<1.33	<1.33	<1.33	<1.33
NDBA	1.33	>10	<1.33	<1.33	<1.33	<1.33	<1.33	<1.33

略語：S/N = シグナル/ノイズ比；PVDF = 親水性ポリフッ化ビニリデン；PTFE = 親水性ポリテトラフルオロエチレン；LOQ = 定量下限値；ND = 未検出

特にきわめて感度の高い装置を使用する方法では、ろ過装置に、データ品質に負の影響を及ぼしかねない化学的溶出物が存在しないようにすることが重要です。溶出物は分析対象物のピークと同時に溶出される可能性があるか、または下流分析において予測されないピークとして出現する可能性があり、データの解釈が困難になるため避ける必要があります。溶出物の発生源は、フィルターの脱落、製造プロセスからの残留化学物質、およびフィルターを洗い流す二次化学物質を由来とします。ニトロソアミン化合物などの特定の分析対象物の場合、溶出物がメンブレンの成形プロセス中に偶発的に生成する可能性があります。

パート2－バルサルタンにおける回収率

バルサルタンサンプルを低濃度（L2）の標準物質でスパイクすることによって回収試験を実施しました。調製済みサンプル溶液を、LS-MS/MSにより分析し、外部較正曲線を用いて個々の分析対象物の濃度を算出しました。サンプル溶液中および外部較正溶液中の内部標準のシグナルと分析対象物のシグナルの比（例：NDMA-D₆のシグナル／NDMAのシグナル）を決定しました。

表6に、 試験を行ったPVDFおよびPTFEシリンジフィルターの平均回収率を示しています。試験を行ったすべての装置および材質について、すべての化合物の回収率が許容範囲である70～130%³¹内でした。化合物およびフィルター材質間で一部に若干の差が認められました。例えば、NDBAは回収率が比較的低く（ただし許容範囲内）、これはおそらくろ材または製剤中の成分との疎水性相互作用によるものと考えられました。Millex^®親水性PVDFおよびPTFEシリンジフィルターはいずれも、ロット間で一貫した回収率を示しました。

表6. 6種類のニトロソアミン化合物の平均回収率。値は1ロットあたり試験した3個の装置の平均値±標準偏差を示す。

化合物名	スパイク濃度 (ng/mL)	PVDFメンブレン搭載シリンジフィルター			PTFEメンブレン搭載シリンジフィルター
		Millex®	ベンダーP	ベンダーM	Millex®	ベンダーC	ベンダーM
NDMA	2.0	95.6±2.5	95.6±4.0	91.2±1.2	92.7±0.3	94.6±1.0	94.2±1.2
NMBA	2.0	101.1±1.5	99.9±1.6	97.8±0.2	98.6±2.0	97.5±2.3	101.4±0.2
NDEA	0.88	101.4±2.6	101.9±1.2	99.0±3.4	102.4±1.9	100.2±1.9	98.6±1.6
NEIPA	2.0	95.6±1.1	94.6±3.7	92.1±1.1	99.5±3.1	94.6±2.7	93.1±1.3
NDIPA	2.0	92.4±3.8	94.8±3.7	91.6±2.5	99.5±0.6	98.1±0.2	99.2±1.5
NDBA	2.0	83.6±1.8	85.4±5.9	83.6±3.9	82.1±0.9	85.5±1.5	84.2±3.2

ろ過装置への分析対象物分子の結合により回収率が低下するため、シリンジフィルターの材質を選択する際にはこの点も考慮すべき因子です。ろ過装置（メンブレンフィルターおよびハウジング）の物理化学的特性および分析対象物の化学的性質が結合の程度を決定します。静電的相互作用、水素結合、疎水性相互作用などのさまざまな二次的相互作用がメンブレンフィルターやハウジングへの分析対象物の結合に寄与します³²。本試験において、PVDFおよびPTFEメンブレンフィルターを用いたNDMAの回収率が比較的低かった（ただし許容範囲内）理由は、NDMAとメンブレンの疎水性相互作用が原因であると考えられました。NDIPAはPVDFメンブレンによる回収率が低く、この分子はPVDFポリマーとの相互作用がPTFEポリマーとの相互作用とは異なる可能性が示されました。極性官能基を有し、非特異的結合の傾向が強い他のポリマー（ナイロンなど）は結合率が高い可能性が示され、分析対象物の喪失量が多いと考えられます。最も正確な回収率を得るために、米国FDAのニトロソアミン類の試験で推奨されているとおり、サンプル調製時のろ液の最初の1 mLを廃棄することが提案されています^23,24。これにより、結合部位が分析対象物で飽和されるため、さらなる分析対象物の喪失が発生しません。私たちは、ナイロンなどのさらに結合率が高いメンブレン材質でこの現象を認めました。

ニトロソアミン類不純物試験とフィルター選択

試験を行ったすべてのPVDFおよびPTFEシリンジフィルターにおいて、ニトロソアミン類溶出物の量はUSP <1469> Procedure 3に従った検出下限値未満であることが示されました。さらに、すべてのスパイク済みニトロソアミン分析対象物の回収率は許容範囲内であり、化合物間の差はわずかでした。このことから、ニトロソアミン類分析法のサンプル調製においてこれらのろ材を使用することの適切性が示されています。

関連アプリケーション

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