サイズ排除クロマトグラフィーの試料調製

クロマトグラフィー用に精製された試料は、きれいで、粒子状物質がないものでなければなりません。精製開始前に試料を清澄化する単純な工程によりカラムの目詰まりを回避し、厳格な洗浄手順の必要性を削減し、クロマトグラフィー担体の寿命を延ばすことができます。

試料抽出手順と、バッファー、添加剤、および洗浄溶媒の選択は、主に材料の供給源、標的分子の安定性、使用するクロマトグラフィー技法、および製品の使用目的によって決まります。これらの題目は、サイティバ（Cytiva）から入手できる一般的な「タンパク質精製ハンドブック」、標的分子に応じてさらに具体的な「組換えタンパク質ハンドブック」および「抗体精製ハンドブック」で扱われています。

試料の清澄化

遠心分離およびろ過は試料清澄化のための標準的なラボ手技であり、少量の試料を取り扱う際に日常的に使用されます。

クロマトグラフィーによる精製の直前に、あらゆる試料を遠心分離およびろ過することを強く推奨します。

遠心分離

遠心分離では、脂質や、細胞残渣などの粒子状物質が取り除かれます。遠心分離後も試料がまだ清澄化されていない場合は、第1段階としてろ紙または5 μmフィルターを使用し、第2段階のフィルターとして下記のフィルターのうち1つを使用します。

• 少量の試料またはフィルターに吸着するタンパク質は10,000 × gで15分間遠心分離します。
• 細胞溶解物は40,000～50,000 × gで30分間遠心分離します。
• 血清試料は、遠心分離後にグラスウールフィルターでろ過することにより残存する脂質を除去できます。

ろ過

ろ過では粒子状物質が取り除かれます。タンパク質の非特異的結合の量を最小限に抑えるメンブレンフィルターは、酢酸セルロースまたはPVDFでできています。

クロマトグラフィー前の試料前処理では、クロマトグラフィー担体のビーズ径と関連してフィルターの孔径を選択します（表A3.1）。

表A3.1 推奨するフィルター孔径

フィルターの孔径	クロマトグラフィー担体の粒子径
1 μm	90 μm以上
0.45 μm	34 μm
0.22 μm	3、10、15 μm、または特にきれいな試料や滅菌ろ過が必要な場合

テストランで標的タンパク質の回収率を確認します。一部のタンパク質は、フィルター表面に非特異的に吸着する恐れがあります。

脱塩

変性処理

表A3.2 一般的な変性剤

変性剤	代表的な使用条件	除去／コメント
尿素	2～6 M	Sephadex G-25を使用して除去
グアニジン塩酸塩	3～6 M	Sephadex G-25を使用して除去

詳細の出典：Scopes R.K., Protein Purification, Principles and Practice, Springer, (1994), J.C. Janson and L. Rydén, Protein Purification, Principles, High Resolution Methods and Applications, 2nd ed. Wiley Inc, (1998) ほか

沈殿および再可溶化

脂質、リポタンパク質、フェノールレッドといった、カラムに蓄積する可能性のある汚染物質が粗試料に含まれていることがわかっているときは、特定の試料前処理工程が必要になる場合があります。大量のタンパク質など、一定量の肉眼で見える不純物をクロマトグラフィー工程の前に除去する必要がある場合も試料の前処理が必要になることがあります。

分画沈殿法は、肉眼で見える不純物を除去するのに時折ラボ規模で使用されますが、アフィニティータグ付きタンパク質の精製には一般に必要ありません。場合によっては、沈殿がタンパク質の濃縮と精製の複合工程として有用です。

沈殿法では、吸収率較差溶解度の原理によって画分を分けます。例えば、タンパク種は疎水度がさまざまであるため、塩濃度を高めるとタンパク質間の疎水性相互作用が強まり、沈殿を引き起こすことがあります。分画沈殿法を適用すると、図A3.1に示すように肉眼で見える不純物を3つの異なる方法で除去できます。

図A3.1. 沈殿を利用する3つの方法

沈殿法は温度、pH、および試料濃度の影響を受けることがあります。

再現性のある結果を保証するには、これらのパラメータを管理しなければなりません。
ほとんどの沈殿法は大量の前処理に適していません。

表A3.3 沈殿法の例

沈殿剤	代表的な使用条件	試料の種類	コメント
硫酸アンモニウム	以下の説明どおり。	1 mg/mL超のタンパク質、特に免疫グロブリン。	タンパク質を安定化し、変性させません。上清を直接HICに供することができます。脂質含有量を減らすのに有用です。
デキストラン硫酸	試料1 mLにつき10%デキストラン硫酸0.04 mLおよび1M塩化カルシウム1 mLを添加し、15分間混合後に10,000 × gで遠心分離し、ペレットを廃棄します。	腹水など、高濃度のリポタンパク質を含む試料。	リポタンパク質を沈殿させます。
ポリビニルピロリジン	3%（w/v）を添加し、4時間撹拌後に17,000 × gで遠心分離し、ペレットを廃棄します。	腹水など、高濃度のリポタンパク質を含む試料。	デキストラン硫酸の代替となります。
ポリエチレン・グリコール（PEG、Mr > 4000）	最大20%（w/v）。	血漿タンパク質。	変性させません。上清を直接IEXまたはACに供します。完全な除去は困難な場合があります。タンパク質を安定化します。
アセトン（冷）	0 °Cで最大80%（v/v）。	微量遠心機によって最大速度で遠心分離後、ペレットを回収します。	タンパク質を不可逆的に変性できます。ペプチド沈殿または電気泳動用試料の濃縮に有用です。
ポリエチレンイミン	0.1%（w/v）。		凝集した核タンパク質を沈殿させます。
硫酸プロタミン	1%（w/v）。		凝集した核タンパク質を沈殿させます。
硫酸ストレプトマイシン	1%（w/v）。		核酸を沈殿させます。
カプリル酸	（X/15）g、ここで、Xは試料容量。	抗体濃度は1 mg/mLを超えている必要があります。	血清または腹水中の免疫グロブリンを溶液中に残したまま、大量のタンパク質を沈殿させます。

詳細の出典：Scopes R.K., Protein Purification, Principles and Practice, Springer, (1994), J.C. Janson and L. Rydén, Protein Purification, Principles, High Resolution Methods and Applications, 2nd ed. Wiley Inc, (1998).

硫酸アンモニウムによる沈殿

硫酸アンモニウムによる沈殿は、最初の試料濃縮および洗浄によく使用されます。塩濃度が上がるにつれてタンパク質が「塩析」し始めます。タンパク質ごとに異なる濃度で塩析するため、粗抽出液から汚染したタンパク質を除去するのに利用できるプロセス。汚染物質を除去し、目的のタンパク質は除去しないように塩濃度を最適化する必要があります。その後、塩濃度を上げた追加工程で標的タンパク質が沈殿するはずです。標的タンパク質を安全に沈殿させて再溶解できない場合は、最初の工程のみ行う必要があります。試料にはすでに高濃度の塩が含まれ、追加の前処理をまったく、またはほとんど行う必要なくHICカラムに直接適用できるため、HICは、多くの場合に優れた次の精製工程になります。塩濃度を上げると、試料の疎水性成分とクロマトグラフィー担体間の相互作用が強化されます。

沈殿に必要な溶液：

• 硫酸アンモニウムの飽和溶液（硫酸アンモニウム100 gを蒸留水100 mLに加え、撹拌して溶解させます）。
• 1 M Tris-HCl、pH 8.0。
• 最初の精製工程のためのバッファー。

一部のタンパク質は、硫酸アンモニウムによって損傷を受けることがあります。結晶の硫酸アンモニウムは注意して添加してください。局所的に高濃度になると、不要なタンパク質で沈殿物が汚染されることがあります。

定型的で再現性のある精製では硫酸アンモニウムによる沈殿を避け、クロマトグラフィーを使用すべきです。

一般に、1 mg/mL未満の濃度のタンパク質に沈殿はほとんど効果がありません。

1. 試料をフィルター（0.45 μm）でろ過するか、または遠心分離（4 °Cで10,000 × g）します。
2. pHを保つには、試料容量10に対して容量1の1M Tris-HCl（pH8.0）を添加します。
3. ゆるやかに撹拌します。硫酸アンモニウム溶液を1滴ずつ添加します。50%飽和状態となるまで添加します*。1時間撹拌します。
4. 10,000 × gで20分間遠心分離します。
5. 上清を除きます。濃度が同じ等量の硫酸アンモニウム溶液（沈殿したタンパク質を再溶解しない、またはさらに沈殿を生じさせない溶液）中で再懸濁してペレットを2回洗浄します。再び遠心分離します。
6. 次の工程で使用する少量のバッファー中でペレットを再溶解します。
7. 硫酸アンモニウムは、脱塩カラムを用いたSephadex G-25による清澄化／バッファー交換工程で除去されます（第5章を参照）。

*飽和度を調整することにより、標的分子を沈殿させたり汚染物質を沈殿させたりできます。

所与の飽和度に到達するのに必要な硫酸アンモニウムの量は温度によって変わります。表A3.4 に20 °Cで必要な量を示します。

表A3.4 20 °Cで所与の飽和度に到達するのに必要な硫酸アンモニウム量

達すべき最終パーセント飽和度
	20	25	30	35	40	45	50	55	60	65	70	75	80	85	90	95	100
開始パーセント	20 °Cの溶液1Lごとに加える硫酸アンモニウム量（g）
0	113	144	176	208	242	277	314	351	390	430	472	516	561	608	657	708	761
5	85	115	146	179	212	246	282	319	358	397	439	481	526	572	621	671	723
10	57	86	117	149	182	216	251	287	325	364	405	447	491	537	584	634	685
15	28	58	88	119	151	185	219	255	293	331	371	413	456	501	548	596	647
20	0	29	59	89	121	154	188	223	260	298	337	378	421	465	511	559	609
25		0	29	60	91	123	157	191	228	265	304	344	386	429	475	522	571
30			0	30	61	92	125	160	195	232	270	309	351	393	438	485	533
35				0	30	62	94	128	163	199	236	275	316	358	402	447	495
40					0	31	63	96	130	166	202	241	281	322	365	410	457
45						0	31	64	98	132	169	206	245	286	329	373	419
50							0	32	65	99	135	172	210	250	292	335	381
55								0	33	66	101	138	175	215	256	298	343
60									0	33	67	103	140	179	219	261	305
65										0	34	69	105	143	183	224	267
70											0	34	70	107	146	186	228
75												0	35	72	110	149	190
80													0	36	73	112	152
85														0	37	75	114
90															0	37	76
95																0	38

リポタンパク質の除去

リポタンパク質とその他の脂溶性物質はクロマトグラフィーカラムをすぐに詰まらせることがあるため、精製開始前にそれらを除去することを推奨します。デキストラン硫酸、ポリビニルピロリジンなどの沈殿剤は、分画沈殿法で説明したように、腹水などの試料から高濃度のリポタンパク質を除去するのに推奨します。

試料を遠心分離し、標的分子がフィルターに非特異的に結合するリスクを回避します。

血清などの試料は、グラスウールフィルターでろ過して残存する脂質を除去できます。