ホームタンパク質プルダウンアッセイ免疫沈降キット（プロテインA）のプロトコルとトラブルシューティング

免疫沈降キット（プロテインA）のプロトコルとトラブルシューティング

Immobilized プロテインAを使用した免疫沈降

免疫沈降は、タンパク質の複雑な混合物に含まれる標的抗原の分析に使用されます。目的のタンパク質の濃縮と精製は、特定の抗体を使用して分析スケールでワンステップで行えます。多くの場合、免疫沈降したタンパク質は機能的にアクティブであり、酵素活性、相互作用、修飾、構造についてさらに分析することができます。

本キット（製品番号11719394001）には、タンパク質の細胞溶解、可溶化、安定化、および免疫精製に必要なすべての試薬が含まれています。

免疫沈降プロトコル

細胞溶解とサンプル調製

1.細胞／組織を氷冷PBSで少なくとも2回洗浄して、残っている血清タンパク質を培地からすべて除去します。免疫沈降反応1回あたり1〜3 mLのサンプル量が推奨されます。マイクロ遠心分離機を使用する場合は、1 mLの容量が最適です。

PBSを単層に添加し、上清を廃棄することによって、付着細胞を洗浄します。+2〜+8℃に冷却した溶解バッファーを、冷却して洗浄した細胞層に加えて、10⁶〜10⁷細胞／mLの濃度にします。適切な器具を使用して、培養皿の片側に細胞をこすり落とします。
懸濁液中の細胞は、遠心分離とペレットの再懸濁によってPBSで洗浄する必要があります。最後の洗浄後に上清を取り除きます。+2〜+8℃に冷却した溶解バッファーに細胞ペレットを再懸濁して、10⁶〜10⁷細胞／mLの濃度になったら、適切な均質化デバイスに移します。
PBSを添加し、上清を廃棄することによって、固体組織を洗浄します。サンプルに溶解バッファーを加えて、5〜20 mg組織／mLの濃度にします。

2.氷上で事前に冷却しておいたDounceホモジナイザーまたは別のタイプのマイクロホモジナイザーにサンプルを移します。均質化手順は、標的抗原の機能的完全性を維持する上で重要となる可能性があります。タイプBの乳棒を使用して、ストロークを（約10回）繰り返して均質化します。

3.均質化した懸濁液を12,000 × g、+2〜+8℃の条件下で10分間、卓上マイクロフュージで遠心分離し、破片を取り除きます。または、高速遠心分離で上清を調製するには、100,000 × g、+2〜+8℃の条件下で45分間、遠心分離します。

4.上清を分離し、マイクロフュージチューブ（最適量1 mL）に移します。

プロテインAアガロースによる前処理

プロテインAアガロースへの無関係な細胞内タンパク質の非特異的吸着によるバックグラウンドを減らすため、前処理ステップが推奨されます。

5.50 µLの均一なプロテインAアガロース懸濁液（25 µLのベッド容量）を1〜3 mLのサンプルに加えて、+2〜+8℃で少なくとも3時間またはロッキングプラットフォーム上で一晩インキュベートします。

6.12,000 × gの条件下で20秒間、マイクロフュージ内で遠心分離にかけるか、重力沈降によってビーズを沈殿させます。上清を新しいチューブに移します。

標的タンパク質の免疫沈降

7.適切な量の特異抗体を加えて、+2〜+8℃で1時間軽く振とうします。

8.50 µLの均一なプロテインAアガロース懸濁液を混合物に加えて、+2〜+8℃で少なくとも3時間またはロッキングプラットフォーム上で一晩インキュベートします。

9.12,000 × gの条件下で20秒間、マイクロフュージ内で遠心分離にかけるか、重力沈降によって複合体を収集します。

10.上清を慎重に取り除き、1 mLの洗浄バッファー1を加えて、ビーズを再懸濁し、ロッキングプラットフォーム上で+2〜+8℃で20分間インキュベートします。

11.ステップ9および10を繰り返します。

12.ステップ9の説明に従って複合体を収集して上清を除去し、ペレットを1 mLの洗浄バッファー2に再懸濁してから、ロッキングプラットフォーム上で+2〜+8℃で20分間インキュベートし、ビーズを沈殿させて上清を取り除きます。

13.ステップ12を繰り返します。

14.ペレットに1 mLの洗浄バッファー3を加えて再懸濁し、+2〜+8℃の条件下で20分間、ロッキングプラットフォーム上でインキュベートし、ビーズを沈殿させて上清を取り除きます。

15.アガロースペレットとマイクロフュージチューブの壁と蓋から最終洗浄の最後の痕跡を取り除きます。

ゲル電気泳動

免疫沈降したタンパク質は、十分なタンパク質分解能を提供する任意のタイプの一次元または二次元電気泳動システムによって分離できます。SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動または二次元電気泳動の詳細なプロトコルについては、教科書または電気泳動装置メーカーのマニュアルを参照してください。

25〜75 µLのゲルローディングバッファーを免疫沈降物に加えます。
100℃で3分間加熱してタンパク質を変性させます。12,000 × g、+15〜+25℃の条件下で20秒間、マイクロフュージ内で遠心分離することにより、プロテインAアガロースを除去します。上清を新しいチューブに移します。
SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動でサンプルの一部を分析します。

ウェスタンブロッティング

電気泳動後、標準的なウェスタンブロット法プロトコルを使用して、ゲルをニトロセルロースまたはPVDFメンブレンに転写します。メンブレンの損傷や汚染を防ぐため、取り扱い時には常に手袋を着用してください。

PVDFなどの疎水性メンブレンは、メタノールで数秒間湿らせ、転写バッファーに少なくとも5分間浸す必要があります。ニトロセルロースを短時間水に浸してから、転写バッファーに少なくとも5分間浸します。
転写する前に、転写バッファーでゲルを5〜10分間完全に平衡化しておくことが重要です。
標準プロトコルに従って転写します。
転写産物は、必要に応じて冷蔵庫で数か月間乾燥状態で保管できます。ただし、免疫検出を開始する前に再度湿らせる必要があります。PVDFメンブレンは、メタノールまたは5% Tween® 20（v/v）溶液で再度湿らせる必要があります。

トラブルシューティング

シグナルがない

サンプル調製時の免疫沈降

サンプル調製中の抗原分解のリスクを減らすため、特異的プロテアーゼ阻害剤を追加します。
一次抗体の濃度を5 µg/mLまで増やします。
低親和性抗体の場合は、ストリンジェンシーの低い洗浄バッファーを使用します（たとえば、150 mM NaCl、界面活性剤なし）。
プロテインAアガロースに対する一次抗体の親和性を確認します。一次抗体の親和性が低いことが判明した場合は、適切なマトリックスに変更してください。

検出

ウェスタンブロットの実行時にタンパク質がメンブレンに適切に転写されているかどうかを確認します。転写効率が低い場合（特に高分子量タンパク質の場合）は、転写条件を変更します（転写時間の延長、流量の増加、代替転写バッファーへの変更など）。
高分子量バンドが欠落している場合は、転写時間を長くするか、転写バッファーを変更します。
二次抗体コンジュゲートの酵素活性を確認します。酵素コンジュゲートのさまざまな希釈液をブロッティングメンブレンに点在させ、直接検出します。シグナルが出現しない場合は、新しい酵素コンジュゲートを使用し、同じ方法でテストします。それでもシグナルが出現しない場合は、検出試薬を確認します。

シグナルが弱い

サンプル調製と免疫沈降

サンプル調製中の抗原分解のリスクを減らすため特異的プロテアーゼ阻害剤を追加します。
一次抗体の濃度を最適化します。
一次抗体を使用したインキュベーション時間を+2〜+8℃で数時間に延長します。
プロテインAアガロースを使用したインキュベーション時間を長くします（一晩）。
洗浄時間を短くします。ストリンジェンシーの低い洗浄バッファーを使用します（150 mM NaCl、界面活性剤なし）。

検出

ゲルに適用するタンパク質の量を増やします。
転写効率が高いことを確認します。
検出時間を長くします。

高バックグラウンド

サンプル調製と免疫沈降

バックグラウンドが高いサンプルでは、プロテインAに非特異的に結合するタンパク質をすべて除去するために、数ラウンドの事前吸着処理が必要になる場合があります。
免疫沈降後の抗体-プロテインAアガロース複合体の洗浄時間を長くします。洗浄条件を厳しくします。
ブロット上のバックグラウンドシグナルの上昇は、プロテインAアガロース／抗原複合体の遠心分離中にタンパク質が非特異的にトラップされることが原因で起きる可能性があります。この問題は、遠心分離の代わりに複合体の重力沈降を行うことによって回避できます。

検出

清潔な機器、新しく調製したバッファー、新しいメンブレンを使用します。
サンプル中のタンパク質濃度を希釈します。
メンブレンに触れないようにします。手袋を着用し、先端が鋸歯状になっていない鈍端の鉗子を使用します。

非特異的なバンドがある

プロテインA/Gに非特異的に結合するタンパク質をすべて除去するため、免疫沈降ステップの前にプロテインAアガロースでサンプルを最大3回プレクリア処理します。プロテインAアガロースのプレクリア処理中に血清免疫グロブリンを完全に除去できない場合は、細胞溶解前に無血清細胞培養条件を整えておくことが推奨されます。または、必要な量の特異的抗体をプロテインAアガロースに事前にロードし、残りのプロテインA結合部位は、非特異的コントロール抗体または血清でブロックすることもできます。