Acqua ultrapura per terreni di coltura esenti da BPA
Merina Corpinot, PhD1, Maurizio Zuccotti, PhD2, Daniel Darbouret, PhD1
1R&D Department, Lab Water Solutions, Merck, Guyancourt, France, 2Laboratory of Developmental Biology, Department of Biology and Biotechnology “Lazzaro Spallanzani”, University of Pavia, Italy
L’obiettivo di questo studio è stato quello di mettere a punto una tecnica per rilevare livelli ridotti dell’interferente endocrino bisfenolo A (BPA) nell’acqua e, più specificamente, di documentare come un sistema per la purificazione dell’acqua Milli-Q® IQ 7000 corredato di un ultrafiltro Biopak® (configurazione raccomandata per le applicazioni di biologia molecolare) produca acqua ultrapura di riferimento, idonea per gli studi di embriologia sensibili al BPA.
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- Preoccupazioni per la salute circa gli interferenti endocrini come il bisfenolo A
- Studio 1: analisi HP-SPME-GC-MS finalizzate alla determinazione del BPA nell’acqua ultrapura utilizzata in studi di embriologia
- Studio 2 - Acqua ultrapura esente da BPA per analisi citologiche e molecolari finalizzate a valutare l'impatto del BPA sulla maturazione degli ovociti
- Studio 3 - Acqua ultrapura esente da BPA impiegata per preparare i terreni utilizzati nella tecnologia di imaging cellulare
- Conclusioni - Acqua ultrapura per applicazioni sensibili al BPA in studi di embriologia
- Materiali e metodi impiegati nelle analisi HP-SPME-GC-MS del BPA
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Preoccupazioni per la salute circa gli interferenti endocrini come il bisfenolo A
Gli interferenti endocrini sono sostanze chimiche che, interferendo con il funzionamento del sistema endocrino di uomini e animali, ne influenzano la crescita, la riproduzione, il sistema immunitario e quello nervoso, con ricadute negative per la salute. Presenti nelle materie plastiche (compresi i consumabili e le attrezzature di laboratorio), nelle lacche, nelle resine e nei tensioattivi, gli interferenti endocrini sono considerati onnipresenti.
Regolamenti e norme stabiliscono le dosi massime di interferenti endocrini ammesse in alimenti e bevande e ne regolamentano la presenza nell'ambiente. Tra i vari interferenti endocrini di origine industriale, il BPA è uno dei più diffusi. Il BPA è noto come "xenoestrogeno" in quanto imita l'ormone estrogeno e desta pertanto grandi preoccupazioni per la salute. Diversi studi hanno confermato che il BPA interferisce con la produzione di ormoni e con l'espressione dei geni ad essi correlati. Studi recenti hanno rivelato che anche livelli ridotti di BPA (1 settimana di esposizione fetale a 20 µg/kg/giorno, che costituiscono una dose di BPA rilevante dal punto di vista ambientale) possono pregiudicare la produzione di ovociti sani (Figura 1), interferendo durante la loro crescita all'interno dell'ovaio.1-3
L'obiettivo degli studi descritti qui di seguito è stato quello di dimostrare che la qualità dell'acqua ultrapura (Tipo 1) ottenuta da un sistema di purificazione Milli-Q® è adatta alla preparazione di terreni e soluzioni che garantiscano l'assenza di BPA, in particolare per la realizzazione di un ambiente di coltura privo di BPA per esperimenti di biologia della riproduzione.
- Lo studio 1 mostra i risultati delle determinazioni di BPA condotte in diversi tipi di acqua utilizzando la microestrazione in fase solida ad alte prestazioni accoppiata alla gascromatografia-spettrometria di massa (HP-SPME-GC-MS).
- Lo studio 2 presenta i risultati di analisi citologiche e molecolari finalizzate a valutare l'impatto del BPA sulla maturazione degli ovociti.
- Lo studio 3 mostra l'importanza dell'acqua impiegata per preparare i terreni di coltura utilizzati nella tecnologia di imaging cellulare.
Figura 1.Studi di immunocitochimica al microscopio su un ovocita di topo condotti durante la fase meiotica della metafase II (MII) utilizzando anticorpi contro le proteine dei fusi meiotici (in rosso) e dei centrosomi (in verde). I cromosomi sono stati controcolorati con DAPI (blu).
Studio 1: analisi HP-SPME-GC-MS finalizzate alla determinazione del BPA nell’acqua ultrapura utilizzata in studi di embriologia
Negli studi di biologia della riproduzione, l’acqua è un reagente fondamentale per l’esecuzione delle analisi (ad esempio, nella preparazione dei terreni di coltura).
Ricercatori dell’Università di Pavia hanno utilizzato un metodo HP-SPME-GC-MS riproducibile per analizzare il contenuto di BPA nell’acqua ultrapura che impiegavano nei loro studi di embriologia. L’acqua ultrapura analizzata era erogata da un sistema Milli-Q® IQ 7000 alimentato da acqua pura Elix® prodotta da un sistema, simile ai sistemi Milli-Q® HX, che si avvale di una combinazione di tecnologie di purificazione tra le quali osmosi inversa (RO) d'avanguardia, elettrodeionizzazione (EDI) Elix® e lampada UV battericida. Il sistema per la produzione di acqua ultrapura Milli-Q® IQ 7000 era dotato di un filtro per il trattamento finale al punto d’uso Biopak® (Figura 2). L’ultrafiltro Biopak® è raccomandato per applicazioni di biologia molecolare consentendo l’erogazione di acqua apirogena ed esente da nucleasi, proteasi e batteri.
Figura 2.Schema delle analisi per la determinazione di bisfenolo A (BPA) in diverse tipologie di acqua di laboratorio mediante HP-SPME-GC-MS.
Le analisi HP-SPME-GC-MS hanno mostrato che il BPA non era rilevabile né nell’acqua pura Elix®, né nell’acqua ultrapura Milli-Q® utilizzata per gli esperimenti di laboratorio, con un limite di rivelazione (LOD) pari a 4 nM (Tabella 1).
Come anticipato, l’acqua per le analisi veniva erogata da un filtro per il trattamento finale Biopak®. La Figura 3 mostra un risultato tipico ottenuto analizzando tre campioni d'acqua erogati consecutivamente da un sistema Milli-Q® IQ 7000 dotato di filtro per il trattamento finale al punto d’uso Biopak®. La ripetibilità e la robustezza delle analisi GC-MS, ma anche le variazioni giornaliere di BPA, sono state determinate seguendo le procedure descritte successivamente nel paragrafo Materiali e metodi.
I risultati dimostrano che l’acqua ultrapura prodotta dal sistema Milli-Q® IQ 7000 non contiene livelli rilevabili di BPA (LOD = 4 nM). In particolare, le analisi hanno mostrato che il sistema non rilascia BPA nell’acqua prodotta, visto che il composto non era rilevabile nell’acqua di rete con cui viene alimentato il sistema di purificazione.
Figura 3.Cromatogrammi che mostrano i livelli di BPA in tre campioni di acqua ultrapura. I campioni venivano erogati uno dopo l’altro al punto d’uso di un sistema per la produzione di acqua ultrapura Milli-Q® IQ 7000 dotato di un filtro per il trattamento finale Biopak®.
I due studi seguenti rivelano che un sistema per la produzione di acqua ultrapura Milli-Q® può essere tranquillamente impiegato per erogare acqua di elevata qualità non contaminata da BPA e che questa potrà essere successivamente impiegata nello studio degli effetti di interferenti endocrini sui gameti e sugli embrioni in via di sviluppo, in particolare se filtrata da un filtro per il trattamento finale Biopak®.
Studio 2 - Acqua ultrapura esente da BPA per analisi citologiche e molecolari finalizzate a valutare l'impatto del BPA sulla maturazione degli ovociti
Quando si effettua uno studio per misurare gli effetti di una particolare molecola, l’ambiente sperimentale deve essere esente dalla molecola di interesse. Nello studio qui presentato, i ricercatori si sono avvalsi della qRT-PCR per analizzare l’espressione di trascritti di quattro geni di origine materna, Brg1 (rimodellatore della cromatina), Dnmt3a, Dnmt3l (metilasi del DNA) e Oct-4 (marcatore di pluripotenza cellulare). I campioni erano costituiti da tre pool indipendenti di 10 ovociti murini in metafase II (MII), ottenuti dopo 15 ore di maturazione in-vitro (IVM) di ovociti antrali completamente maturi alla presenza di BPA 10 nM, 100 nM o 1.000 nM.
I risultati hanno rivelato che il BPA non ha arrestato la maturazione meiotica alle tre dosi prese in esame, perché la gran parte (96,5%) degli ovociti ha raggiunto la fase MII, senza differenze significative tra i controlli e i campioni esposti. Tuttavia, l'espressione di tutti i geni testati è risultata significativamente alterata (o più alta o più bassa rispetto ai controlli non trattati) a tutte le concentrazioni di BPA studiate, ad eccezione di Oct-4 che è rimasto inalterato a 10 nM di BPA (Figura 4).
Questi esperimenti di espressione genica sono stati eseguiti utilizzando acqua ultrapura erogata da un sistema di purificazione Milli-Q® IQ 7000 corredato di un filtro per il trattamento finale Biopak®. In base ai risultati, l'acqua ultrapura erogata da questo sistema Milli-Q® è risultata idonea per studi di biologia della riproduzione sensibili al BPA.
Figura 4.Profili d’espressione dei geni di origine materna Brg1, Dnmt3a, Dnmt3l e Oct-4 in ovociti di topo esposti a dosi di BPA di 10, 100 o 1.000 nM nella transizione da GV a MII. I valori di espressione dei campioni controllo (CTR) sono stati assunti come riferimento (valore 1) per il calcolo delle variazioni in termini di numero di volte (n). I valori sono stati espressi come media ± SD. *p < 0,05 **p < 0,001.
Studio 3 - Acqua ultrapura esente da BPA impiegata per preparare i terreni utilizzati nella tecnologia di imaging cellulare
L'imaging in time-lapse ci permette di osservare i movimenti che avvengono all'interno di un ovocita durante la sua transizione dallo stadio di vescicola germinale (GV) alla fase di sviluppo MII (video4). La velocità di questi movimenti, nota come Velocità dei movimenti citoplasmatici (CMV), funge da marker citologico non invasivo per valutare la competenza di sviluppo di un gamete femminile (la qualità e la capacità di un gamete di andare incontro a un ulteriore sviluppo).5,6 Nello studio riportato, si è utilizzata questa nuova tecnica per studiare la CMV durante la transizione GV-MII di ovociti maturati in assenza o alla presenza di concentrazioni crescenti di BPA (la Figura 5 mostra dati rappresentativi solo per la concentrazione 100 nM di BPA).
Analisi di velocimetria a immagini di particelle (PIV) condotte sulle cellule hanno permesso di riscontrare finestre temporali di sviluppo specifiche quando gli ovociti erano sensibili alle dosi di BPA studiate. In particolare, quando venivano esposti alla concentrazione inferiore di BPA, 10 nM, le alterazioni nella CMV erano diffuse in punti temporali singoli, mentre a dosi più elevate, le alterazioni della CMV erano osservabili in un intervallo di tempo prolungato durante la transizione GV-MI. Precisamente, la dose di BPA 100 nM ha determinato differenze significative nell’intervallo temporale in cui la cromatina si condensa e i centromeri si aggregano in grandi cromocentri per formare la piastra metafasica (Figura 5).
I terreni di coltura impiegati nei suddetti esperimenti di CMV sono stati preparati utilizzando acqua ultrapura erogata da un sistema di purificazione Milli-Q® IQ 7000 corredato di un filtro per il trattamento finale Biopak®. I risultati sottolineano la necessità di terreni di coltura privi di BPA, poiché esso anche a basse dosi, come 100 nM, può esercitare effetti, rilevati attraverso l'analisi dell'espressione genica o dei movimenti citoplasmatici.
Figura 5.(A) Immagini rappresentative di un ovocita in fase GV, nel fotogramma 1 (a), e in fase MII nel fotogramma 100 (b). Nei riquadri si osservano immagini in cui frecce (vettori di velocità) indicano l'intensità e la direzione dei movimenti citoplasmatici. Il colore e la lunghezza delle frecce rappresentano il modulo della velocità dei movimenti rispetto al fotogramma precedente. Barra della scala colorimetrica dei vettori (nm/ min): il blu corrisponde a una velocità ridotta, il viola a una velocità elevata. Barra: 10 μm. (B) Profilo dei movimenti citoplasmatici durante la transizione di ovociti di topo dallo stadio GV a MII in assenza (verde) o alla presenza(grigio) di BPA 100 nM. *p < 0,05.
Conclusioni - Acqua ultrapura per applicazioni sensibili al BPA in studi di embriologia
Aumentando la sensibilità e le prestazioni delle tecniche di ricerca, si fa sempre più indispensabile il ricorso ad acqua purificata di alta qualità per evitare contaminazioni che potrebbero compromettere l'accuratezza e l'autenticità dei risultati sperimentali. Soprattutto negli studi che coinvolgono strumenti di indagine pionieristici, gli scienziati necessitano di acqua ad alta purezza per prevenire qualsiasi problema che possa disturbare i loro risultati (ad esempio, BPA, endotossine, nucleasi, proteasi e batteri) e per una maggiore affidabilità delle analisi.
Nel campo dell'embriologia, è stato dimostrato che anche bassi livelli dell'interferente endocrino BPA compromettono la ricerca sull'embriogenesi interferendo con la maturazione degli ovociti. Ciò è preoccupante perché il BPA, anche se non è necessariamente presente in origine nell'acqua della rete idrica che alimenta il laboratorio, può essere rilasciato dai consumabili e dalle attrezzature di laboratorio, interferendo con i risultati sperimentali.
Nel presente articolo, pur avendo dimostrato che bassi livelli di BPA non arrestano la maturazione meiotica, una concentrazione molto bassa di BPA, pari a soli 10 nM, ha influito sia sull'espressione genica, sia sui movimenti che avvengono all'interno di un ovocita durante la transizione dalla vescicola germinale (GV) allo stadio di sviluppo MII. Questi risultati evidenziano la necessità di eseguire esperimenti di embriologia in un ambiente privo di BPA, il che implica l'uso di acqua ultrapura che garantisca livelli non rilevabili di BPA.
Si è dimostrato che l'acqua ultrapura erogata da un sistema di purificazione Milli-Q® IQ 7000 corredato di un filtro Biopak® per il trattamento finale non contiene livelli di BPA rilevabili anche con un limite di rivelazione molto basso, pari a soli 4 nM, come nel metodo utilizzato in questo lavoro. L'acqua ultrapura erogata da questo sistema può quindi essere utilizzata con fiducia per studiare gli effetti degli interferenti endocrini su gameti ed embrioni in via di sviluppo.
Per individuare le soluzioni di purificazione dell'acqua adatte alle esigenze delle analisi sensibili al BPA, non esitate a chiedere aiuto a un esperto di acqua per il laboratorio.
Materiali e metodi impiegati nelle analisi HP-SPME-GC-MS del BPA
Strumenti
- Per effettuare le analisi dell’acqua si è utilizzato un sistema GC/MS a quadrupolo singolo Thermo Scientific DSQII (gascromatrografo TraceGCUltra e spettrometro di massa TraceDSQII) corredato di un autocampionatore CombiPAL (CTC Analytics, Svizzera).
- Ci si è avvalsi di una colonna capillare Restek Rxi-5ms lunga 30 m, con D.I. di 0,25 mm e spessore del film di 0,25 µm (5% difenil- e 95% dimetil-polisilossano – Restek Corporation, Bellefonte, USA) con elio come gas carrier a un flusso costante di 1,0 mL/min.
- Per la preparazione dei campioni si è ricorso a un dispositivo per SPME con fibra in polidimetilsilossano (PDMS) da 100 µm. Per evitare la contaminazione dei campioni dovuta alle analisi precedenti (carryover), prima di ogni analisi si effettuava la pulizia della fibra lasciandola per 20 minuti nell’unità di riscaldamento degli aghi a 250 °C.
Preparazione degli standard
Si è preparata una soluzione madre di BPA in etanolo al 100% di concentrazione 10 nM. Si sono effettuate diluizioni in serie con acqua per HPLC per ottenere una curva di taratura con quattro livelli di concentrazione diversi: 1, 2, 4 e 40 nmol/L.
Esperimento 1 - Valutazione della ripetibilità e della robustezza delle analisi GC-MS
Si sono raccolti consecutivamente tre campioni d’acqua (5 mL) da ciascuna delle tre fonti: rete idrica, sistema Elix® per l’acqua pura e punto d’uso di un sistema per la produzione di acqua ultrapura Milli-Q® IQ 7000 dotato di un filtro per il trattamento finale Biopak®. Prima di raccogliere i campioni, si flussava il sistema erogando 5 L d’acqua.
Esperimento 2 - Valutazione delle variazioni giornaliere della concentrazione di BPA
Ogni 24 ore per tre giorni si raccoglievano tre campioni d’acqua (5 mL) dalla rete idrica, da un sistema Elix® per l’acqua pura e dal punto d’uso di un sistema per la produzione di acqua ultrapura Milli-Q® IQ 7000 dotato di un filtro per il trattamento finale Biopak®. Prima di raccogliere i campioni, si erogavano 5 L d’acqua. I cromatogrammi sono disponibili su richiesta.
Campioni d’acqua
Volumi di 5 mL d’acqua da analizzare (acqua di rete, acqua pura Elix® o acqua ultrapura filtrata da un ultrafiltro Biopak®) venivano introdotti in flaconcini in vetro da 20 mL. In ciascun flaconcino si aggiungevano 200 mg di KHCO3, 1 g di NaCl e un’ancoretta magnetica.
Derivatizzazione
Dopo aver aggiunto 30 µL di anidride acetica a ciascun campione di acqua, si chiudevano i flaconcini con tappi in alluminio per spazio di testa dotati di setti con un lato in politetrafluoroetilene. Dopo 5 minuti a 80 °C (sotto agitazione continua a 50 rpm) la reazione di derivatizzazione era completa. Si procedeva quindi all’estrazione del BPA esponendo nello spazio di testa la fibra rivestita da uno strato di PDMS di 100 µm di spessore a 80 °C per 30 minuti sotto agitazione (500 rpm). La fibra per SPME veniva poi desorbita nell’iniettore a 250 °C per 2 minuti.
Analisi cromatografiche
La temperatura del forno veniva mantenuta a 150 °C per 2 minuti, portata a 280 °C con incrementi di 30 °C/min e mantenuta per 6 minuti. Le iniezioni venivano effettuate in modalità splitless, con tempo di splitless di 2 minuti e temperatura dell’iniettore PTV mantenuta a 250 °C. La temperatura della linea di trasferimento era di 290 °C e quella della sorgente di ionizzazione di 250 °C. La MS veniva condotta mediante elettroionizzazione (EI); gli ioni venivano registrati sia in modalità di scansione totale nell’intervallo di massa m/z 35-350 amu, sia in modalità SIM (monitoraggio ionico selettivo), utilizzando il rapporto m/z 270 come ione per la quantificazione del BPA.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano il Laboratorio di biologia dello sviluppo dell’Università di Pavia per aver condotto la presente ricerca e i nostri colleghi della R&D per il loro contributo a questo progetto
Bibliografia
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