Principio di funzionamento del saggio di ligazione di prossimità (PLA)
- Saggio di ligazione di prossimità (PLA) Duolink®
- Rivelazione della dimerizzazione di EGFR e HER2 usando il saggio di ligazione di prossimità Duolink®
- Kit di controllo per PLA Duolink®
- Tipologie di applicazione dei prodotti Duolink® PLA per la rilevazione di proteine
- Avviamento alla tecnologia Duolink® PLA
Saggio di ligazione di prossimità (PLA) Duolink®
Il saggio di ligazione di prossimità (PLA) Duolink® è uno strumento potente che permette la rivelazione "in situ" di proteine endogene, modificazioni di proteine e interazioni tra proteine. I target proteici sono facilmente rilevabili e localizzabili con una risoluzione a livello di singola molecola all’interno di cellule e tessuti non modificati. Tipicamente, si usano due anticorpi primari indotti in specie diverse che si legano a due target proteici diversi (Figura 1A). Una coppia di anticorpi secondari marcati con oligonucleotidi (le sonde per PLA) si legano poi agli anticorpi primari (Figura 1B). Quindi, degli oligo di ibridazione che fungono da ponte si uniscono alle sonde per PLA solo se queste si trovano in stretta prossimità tra loro e una ligasi forma un DNA stampo circolare e chiuso che va incontro a cicli ripetitivi di amplificazione (rolling-circle amplification o RCA) (Figura 1C). La sonda per PLA agisce quindi da primer per una DNA polimerasi, che genera sequenze di concatameri durante la RCA (Figura 1D). Così il segnale, che rimane sempre ancorato alla sonda per PLA, arriva a essere amplificato fino a 1.000 volte, consentendone la localizzazione. Infine, degli oligo marcati vengono fatti ibridare a sequenze complementari all’interno dell’amplicone (Figura 1E) e vengono poi visualizzati e quantificati sotto forma di punti discreti (segnali del PLA) mediante l’analisi dell’immagine al microscopio (Figura 1F). Il PLA Duolink® può essere eseguito su cellule adese, preparazioni mediante cytospin e sezioni di tessuti su vetrino tramite immunofluorescenza (cioè, rivelazione nel verde, rosso, rosso lontano o arancione) o immunoistochimica (cioè, reazione catalizzata da perossidasi). Il PLA Duolink® può essere condotto anche sul sangue o su cellule in sospensione utilizzando la tecnica della citometria a flusso ed è adatto anche a piastre multipozzetto (per es., a 96 o a 384 pozzetti) in abbinamento a un analizzatore di immagini per lo screening di grandi quantità di dati nelle analisi ad alta produttività. Specificità, sensibilità e versatilità elevate del PLA Duolink® ne fanno il metodo ideale per l’analisi delle vie di segnalazione cellulare e gli studi di cinetica negli screening dei farmaci, per la determinazione del valore della IC50 e per la validazione dei target.
Figura 1. Rappresentazione schematica di una reazione di PLA Duolink®.(A) Due anticorpi primari riconoscono una o più proteine specifiche di interesse presenti all’interno della cellula. I globuli giallo e verde rappresentano due epitopi di una sola proteina o gli epitopi di due diverse proteine interagenti. (B) Gli anticorpi secondari marcati con oligonucleotidi (sonde per PLA) si legano agli anticorpi primari. (C) Quando le sonde per PLA si trovano in stretta prossimità, gli oligo ponte congiungono le sonde per PLA che quindi diventano legate tra loro. (D) Il risultante stampo a DNA circolare chiuso viene amplificato dalla DNA polimerasi. (E) Alcuni oligo complementari accoppiati a fluorocromi per la rivelazione si ibridano a sequenze ripetitive presenti negli ampliconi. (F) I segnali del PLA, in forma di punti discreti, sono rilevati mediante microscopia a fluorescenza e indicano la localizzazione intracellulare della proteina o dell’interazione tra proteine.
Rivelazione della dimerizzazione di EGFR e HER2 usando il saggio di ligazione di prossimità Duolink®
La dimerizzazione del recettore per il fattore di crescita epidermico (EGFR, ErbB1, HER1) e del recettore per il fattore di crescita epiteliale umano 2 (HER2, ErbB2, Neu) è un’interazione proteina-proteina (PPI) ben nota. EGFR e HER2 sono membri della famiglia dei recettori tirosin-chinasici implicati in ruoli chiave nella regolazione della divisione e della morte cellulare. Le mutazioni che influiscono sull’espressione o sull’attività di una di queste due proteine sono associate allo sviluppo di diversi tipi di cancro. Quando un ligando (per es., EGF) si lega al dominio extracellulare di EGFR, il recettore diviene attivato e autofosforila la sua coda citoplasmatica. Ciò induce la formazione di omo- (EGFR-EGFR) ed eterodimeri (per es., EGFR-HER2) con altri membri della famiglia ErbB (Figura 2). La dimerizzazione e la conseguente fosforilazione inducono il reclutamento di proteine adattatrici, l’attivazione delle cascate di segnalazione intracellulare e, infine, cambiamenti a livello di trascrizione genica che possono avere come effetto la proliferazione cellulare, l’angiogenesi, l’invasione, la metastatizzazione e l’inibizione dell’apoptosi.
Figura 2. Rappresentazione schematica della dimerizzazione di EGFR-HER2.I ligandi, per esempio il fattore di crescita epidermico (EGF), si legano al dominio extracellulare di EGFR causandone l’attivazione e l’autofosforilazione. A sua volta, ciò comporta l’omodimerizzazione (non mostrata) o l’eterodimerizzazione con altri membri della famiglia ErbB, come HER2. La dimerizzazione e la conseguente fosforilazione determinano l’attivazione delle vie di trasduzione del segnale a valle. Fonte dell’immagine: Lancet Oncol. 16(15):e543-e554
Duolink® PLA Control Kit – La presenza di PPI conferma la riuscita dell’esperimento
Le cellule di carcinoma ovarico umano SK-OV3 esprimono livelli da moderati ad alti di EGFR e HER2. Per confermare in situ la presenza di dimerizzazione di EGFR-HER2 indotta da EGF è stato usato il kit Duolink® PLA Control Kit – PPI. In ogni kit sono presenti due vetrini con compartimentazione a 8 pozzetti contenenti cellule SKOV3 trattate con EGF e pre-fissate e gli anticorpi primari di topo anti-EGFR e di coniglio anti-HER2. Le concentrazioni ottimali degli anticorpi primari sono predeterminate e nella documentazione allegata al prodotto sono riportate le opportune raccomandazioni. Dopo reidratazione con PBS 1x, le cellule sono state permeabilizzate con Triton X-100 0,2% in PBS 1x per 10 minuti a temperatura ambiente, quindi bloccate con il Duolink® PLA Blocking Buffer per 1 ora a 37 °C. Le cellule nei pozzetti in duplicato sono state poi incubate con entrambi gli anticorpi primari. Per i controlli negativi del saggio, le cellule sono state incubate sia con ciascuno dei due anticorpi primari separatamente sia in assenza degli anticorpi primari, sempre in pozzetti in duplicato (Figura 3). Dopo il lavaggio, è stato eseguito il PLA Duolink® attenendosi al Protocollo per PLA Duolink® in fluorescenza. Tutti i pozzetti sono stati quindi incubati con le sonde per PLA Duolink® anti-rabbit PLUS (anti-coniglio) e anti-mouse MINUS (anti-topo) e i segnali del PLA sono stati generati utilizzando il reagenti di rivelazione rosso lontano Duolink® In Situ Detection Reagent FarRed. I vetrini sono stati montati con l’ausilio del mezzo Duolink® In Situ Mounting Media with DAPI e le immagini sono state acquisite con lo strumento IN Cell Analyzer 2200 di GE.
Figura 3. Duolink® PLA Control Kit – Configurazione del vetrino e posizionamento dei campioni per la verifica della presenza di PPITutti i pozzetti contenevano cellule SK-OV3 stimolate con EGF e pre-fissate. Dopo la permeabilizzazione e il blocco, i pozzetti 1 e 5 sono stati incubati con entrambi gli anticorpi primari di coniglio anti-EGFR e di topo anti-HER2, i pozzetti 2 e 6 sono stati incubati con il solo anticorpo anti-EGFR, i pozzetti 3 e 7 con il solo anticorpo anti-HER2 e i pozzetti 4 e 8 con il solo diluente degli anticorpi.
Risultati simili dell’esperimento di PLA sono stati ottenuti quando i campioni sono stati incubati per 2 ore a 37 °C (Figura 4A-4D) o per una notte a 4 °C (Figura 4E-4H), intervalli più flessibili per l’operatore. Nelle cellule SK-OV3 attivate con EGF la rilevazione di un forte segnale a seguito dell’utilizzo concomitante degli anticorpi primari anti-EGFR e anti-HER2 era indicativo della presenza di molti complessi EGFR:HER2 (Figura 4A, 4E). Nonostante l’uniformità del trattamento delle cellule SK-OV3 con EGF, si è osservata una variabilità del numero di segnali del PLA / complessi EGFR:HER2 tra le cellule. Ciò è probabilmente dovuto all’espressione differenziale di HER2 tra la popolazione delle cellule SK-OV3 (dati non mostrati). Invece, quando è stato usato uno solo degli anticorpi primari o nessuno di essi, i segnali del PLA erano molto deboli (Figura 4B-D, 4F-H). Da notare che concentrazioni troppo elevate degli anticorpi primari possono produrre un maggior numero di segnali del PLA quando usati separatamente e/o possono causare la formazione di agglomerati di segnali del PLA positivi non accuratamente quantificabili (dati non mostrati). È perciò importante attenersi alle concentrazioni di anticorpi primari raccomandate. Nell’insieme, questi dati indicano come i complessi EGFR:HER2 siano rilevabili e quantificabili nelle cellule SK-OV3 stimolate con EGF grazie al Duolink® PLA Control Kit – PPI.
Figura 4. Rivelazione del dimero EGFR:HER2 indotto da EGF utilizzando il PLA Duolink®.Vetrini di cellule SK-OV3 trattate con EGF e prefissate sono stati incubati con gli anticorpi di topo anti-EGFR e di coniglio anti-HER2 (A, E), il solo anticorpo anti-EGFR (B, F), il solo anticorpo anti-HER2 (C, G) oppure con il solo diluente degli anticorpi (D, H) per 2 ore a 37 °C (A-D) o per una notte a 4 °C (E-H). Quindi è stato eseguito il PLA Duolink® impiegando le sonde per PLA PLUS anti-coniglio e MINUS anti-topo. Sono state acquisite 10 immagini 20x per pozzetto, utilizzando i filtri per DAPI (nuclei blu) e Cy5 (segnali PLA rossi). Le immagini sono rappresentative di almeno 5 esperimenti indipendenti.
Tipologie di applicazione dei prodotti Duolink® PLA per la rilevazione di proteine
I prodotti Duolink® PLA sono disponibili per le analisi in fluorescenza e in campo chiaro. I reagenti Fluorescence Duolink® PLA sono al momento utilizzabili sia per le applicazioni di microscopia che di citometria a flusso.
Rivelazione della fluorescenza
La microscopia a fluorescenza è l’applicazione più usata per gli esperimenti di PLA Duolink®. Buona parte del protocollo usato per i reagenti Fluorescence Duolink® PLA è simile a quello dell’immunofluorescenza (IF), tuttavia la tecnologia del PLA Duolink® è caratterizzata da maggiore specificità e versatilità. L’aggiunta della fase di amplificazione nella procedura del PLA Duolink® conferisce maggiore sensibilità.
Rilevazione in campo chiaro
Come con l'immunoistochimica (IHC) tradizionale, il prodotto Brightfield Duolink® PLA si usa prevalentemente su sezioni di tessuto fissate in formalina e incluse in paraffina, ma è compatibile anche con altri tipi di campioni. I reagenti per PLA in campo chiaro Brightfield Duolink® PLA contengono oligonucleotidi marcati con perossidasi di rafano (HRP) che, in presenza di un substrato per la HRP, formano un precipitato enzima:substrato visibile al microscopio ottico.
Citometria a flusso
Il Duolink® Flow PLA Kit è uno strumento di analisi statistica rapido e potente. Questo kit permette di identificare le interazioni tra proteine o la localizzazione a livello subcellulare. Combinando il PLA Duolink® con la citometria a flusso è possibile raccogliere grandi volumi di dati quantitativi.
Avviamento alla tecnologia Duolink® PLA
Il Duolink® PLA Starter Kit contiene tutti i reagenti necessari per eseguire un esperimento di PLA Duolink® e analizzare fino a 30 campioni. Basta solo disporre di campioni cellulari o tissutali pronti, degli anticorpi primari e la normale attrezzatura di laboratorio.
Un Duolink® PLA Starter Kit include:
- due sonde per PLA: una sonda PLUS e una sonda MINUS (corrispondenti alla specie ospite degli anticorpi primari)
- diluente per gli anticorpi e tampone di blocco
- reagente per la rivelazione: a scelta tra rosso o arancione
- tampone per l’amplificazione ed enzima polimerasi
- soluzione madre per la ligazione ed enzima ligasi
- tamponi di lavaggio A e B
- mezzo per montare i vetrini contenente DAPI
Per informazioni dettagliate su come allestire ed eseguire correttamente un esperimento di PLA Duolink®, oltre a fare riferimento ai Protocolli per il PLA Duolink® in fluorescenza, campo chiaro e citometria a flusso, visita anche il nostro Centro Risorse dove troverai:
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