Determinazione dell’ossidazione dei fosfolipidi mediante spettroscopia UV/VIS - Avanti^® Polar Lipids

Definizione

L’ossidazione percentuale di un fosfolipide può essere determinata impiegando la legge di Beer così da calcolare la concentrazione di fosfolipide perossidato in base alla sua assorbanza a 234 nm.

Ambito di applicazione

Applicabile a tutti i fosfolipidi insaturi

Apparato strumentale

• Spettrofotometro UV/VIS
• Cuvetta campione in quarzo HELLMA UV
• Salviette monouso
• Provette in vetro usa e getta

Reagenti

• Etanolo assoluto (100%, disidratato, conforme USP)
• Acqua deionizzata
• 16:0 PC (DPPC)

Procedura

1. Preparazione del campione di DPPC Preparare un minimo di 3 ml di una soluzione a concentrazione pari a 1 mg/ml di dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) disciolta in una miscela etanolo/acqua deionizzata (9:1).
2. Preparazione del campione Preparare un minimo di 3 ml di una soluzione a concentrazione pari a 1 mg/ml del campione di fosfolipide disciolto in una miscela etanolo/acqua deionizzata (9:1).
3. Spettro del bianco Il bianco (fondo) è costituito dal solvente usato per disciogliere i campioni di fosfolipide.
   • Sciacquare per tre volte la cella campione con il solvente, per rimuovere dalla cella qualsiasi residuo di contaminante.
   • Riempire la cella campione per 3/4 con il solvente di riferimento.
   • Utilizzare una salvietta monouso per rimuovere qualsiasi traccia di impronte o di contaminanti dalle pareti esterne della cella campione.
   • Inserire la cella campione nello spettrofotometro e acquisire uno spettro del bianco.
4. Spettro del campione di DPPC
   • Svuotare del solvente (bianco) la cella campione.
   • Riempire 3/4 della cella con la soluzione campione di DPPC.
   • Rimuovere qualsiasi traccia di impronte dalle pareti esterne della cella campione.
   • Inserire la cella campione nello spettrofotometro e acquisire uno spettro del DPPC.
5. Spettro del campione
   • Svuotare del campione di DPCC la cella campione.
   • Sciacquare per tre volte la cella campione con il solvente, per rimuovere dalla cella qualsiasi residuo di DPPC.
   • Riempire per 3/4 la cella campione con il campione di fosfolipide.
   • Rimuovere qualsiasi traccia di impronte dalle pareti esterne della cella campione. Posizionare la cella campione nello spettrofotometro e acquisire uno spettro del campione
   • Sottrarre lo spettro del DPPC dallo spettro del campione e registrare il valore dell’assorbanza del campione di fosfolipide (OD) a 234 nm.

Operazioni di calcolo

Concentrazione del lipide perossidato (D) = A/(B*C)
A = Valore di assorbanza (OD) a 234 nm
B = Coefficiente di estinzione in (OD*ml)/(mmol*cm) (27.000 per il lipide perossidato)
C = passo ottico in cm

Ossidazione percentuale = D/E * 100
D = Concentrazione del lipide perossidato in mg/ml
E = Concentrazione del campione lipidico = 1.0 mg/ml

Bibliografia

1. Kim R, LaBella F. 1987. Comparison of analytical methods for monitoring autoxidation profiles of authentic lipids. J. Lipid Res. 28:1110-1117.