Protocollo per l’uso di TRI Reagent^®

A che cosa serve TRI Reagent^®?

TRI Reagent^® (commercializzato anche con il nome di TRIzol) è una miscela di tiocianato di guanidina e fenolo in una soluzione monofasica che serve per isolare il DNA, l’RNA e le proteine da campioni biologici di origine umana, animale, vegetale, batterica, virale e di lievito. Inibisce l’attività delle RNasi. TRI Reagent^® si usa per omogeneizzare il campione biologico da cui si estraggono l’RNA, il DNA o le proteine.

Procedure

Preparazione dei campioni

1A. Tessuto
Omogeneizzare i campioni di tessuto in TRI Reagent (1 mL/50–100 mg di tessuto) in un omogeneizzatore Polytron^® o simili.

Nota: se si desidera un DNA poco frammentato, usare un omogeneizzatore che non eserciti una forza eccessiva, quindi non il Polytron (vedere Isolamento del DNA, passaggio 3, nota b). Il volume di tessuto non deve superare il 10% del volume del TRI Reagent.

1B. Cellule monostrato
Lisare le cellule direttamente nella piastra di coltura. Per una piastra di vetro per colture cellulari di area utile pari a 10 cm² usare 1 mL di TRI Reagent. Dopo aver aggiunto il reagente, passare più volte il lisato cellulare attraverso il puntale di una pipetta per ottenere un lisato omogeneo.

Nota: TRI Reagent non è compatibile con piastre di plastica per colture cellulari.

1C. Cellule in sospensione
Centrifugare le cellule per pellettarle, quindi lisare in TRI Reagent pipettando ripetutamente. Per lisare 5–10 × 10⁶ cellule animali, vegetali o di lievito o 10⁷ cellule batteriche è sufficiente 1 mL di reagente.

N.B.

• Se i campioni sono ad alto contenuto di lipidi, proteine, polisaccaridi o materiale extracellulare, come tessuto muscolare, adiposo o parti tuberose di tessuti vegetali, potrebbe essere necessario un ulteriore passaggio. Dopo l’omogeneizzazione, centrifugare l’omogenato a 12.000 × g per 10 minuti a 2–8 °C per rimuovere il materiale insolubile (membrane extracellulari, polisaccaridi e DNA ad alta massa molecolare). Il surnatante contiene RNA e proteine. Se il campione è ad alto contenuto lipidico, sulla superficie della fase acquosa sarà presente uno strato di materiale lipidico che va rimosso. Trasferire il surnatante limpido in una provetta nuova e procedere al passaggio 2. Recuperare il DNA ad alta massa molecolare dal pellet attenendosi a quanto indicato nel paragrafo Isolamento del DNA, passaggi 2 e 3.
• Alcune cellule batteriche e di lievito potrebbero richiedere un omogeneizzatore.
• Dopo l’omogeneizzazione o la lisi delle cellule in TRI Reagent, i campioni possono essere conservati a –70 °C al massimo per 1 mese.

Separazione delle fasi: affinché la dissociazione dei complessi nucleoproteici sia completa, lasciar riposare il campione per 5 minuti a temperatura ambiente. Aggiungere 0,1 mL di 1‑bromo-3‑cloropropano o 0,2 mL di cloroformio (vedere il paragrafo Separazione delle fasi, note a e b) per mL di TRI Reagent usato. Sigillare bene il campione, agitare vigorosamente per 15 secondi, quindi lasciar riposare per 2–15 minuti a temperatura ambiente. Centrifugare la miscela risultante a 12.000 × g per 15 minuti a 2–8 °C. La centrifugazione separa la miscela in 3 fasi: una fase organica rossa (contenente le proteine), una interfase (contenente il DNA) e una fase acquosa superiore incolore (contenente l’RNA).

N.B.

• L’1-bromo-3-cloropropano è meno tossico del cloroformio e utilizzandolo per separare le fasi si riduce la possibilità di contaminare l’RNA con il DNA.⁴
• Il cloroformio usato per la separazione delle fasi non deve contenere alcol isoamilico né altri additivi.
• Per la separazione della frazione di RNA con coda di poli-A⁺ dalla fase acquosa vedere il punto I dell’Appendice.

Isolamento ed estrazione dell’RNA

1. Trasferire la fase acquosa in una provetta nuova e aggiungere 0,5 mL di 2-propanolo per mL di TRI Reagent usato nel paragrafo Preparazione del campione, passaggio 1, e miscelare. Lasciar riposare il campione per 5–10 minuti a temperatura ambiente. Centrifugare a 12.000 × g per 10 minuti a 2–8 °C. L’RNA precipitato formerà un pellet sulla parete e sul fondo della provetta.

Nota: conservare a 2–8 °C l’interfase e la fase organica per isolare successivamente il DNA e le proteine.

2. Rimuovere il surnatante e lavare il pellet dell’RNA aggiungendo un minimo di 1 mL di etanolo 75% per 1 mL del TRI Reagent usato nel paragrafo Preparazione del campione, passaggio 1. Vortexare il campione e quindi centrifugarlo a 7.500× g per 5 minuti a 2–8 °C.

N.B.

• Se il pellet dell’RNA galleggia, eseguire il lavaggio in etanolo 75% a 12.000 × g.
• I campioni in etanolo sono conservabili a 2–8 °C per almeno 1 settimana e a –20 °C al massimo per 1 anno.

3. Essiccare brevemente (5–10 minuti) il pellet dell’RNA asciugandolo all’aria o con il vuoto. Non lasciar essiccare completamente il pellet dell’RNA, perché ciò ne diminuirebbe drasticamente la solubilità. Non essiccare il pellet dell’RNA mediante centrifugazione sotto vuoto (Speed-Vac®). Aggiungere un volume appropriato di formammide, acqua o una soluzione di SDS allo 0,5% al pellet dell’RNA. Per facilitare la dissoluzione, miscelare pipettando ripetutamente con una micropipetta mantenendo il campione a 55–60 °C per 10–15 minuti.

N.B.

• La preparazione finale dell’RNA non contiene né DNA né proteine. Il rapporto A260 / A280 deve essere ≥1,7.
• Rese ottenute tipicamente da tessuti (mg RNA/mg tessuto): fegato, milza, 6‑10 mg; rene, 3‑4 mg; muscolo scheletrico, cervello, 1‑1,5 mg; placenta, 1‑4 mg.
• Rese ottenute tipicamente da cellule in coltura (mg RNA/10⁶ cellule): cellule epiteliali, 8‑15 mg, fibroblasti, 5-7 mg.
• La colorazione dell’RNA con bromuro di etidio nel gel di agarosio rileva due bande prevalenti di RNA ribosomiale di dimensioni piccole (2 kb) e grandi (5 kb), RNA di massa molecolare bassa (0,1–0,3 kb) e bande discrete di RNA di massa molecolare alta (7-15 kb).

Isolamento ed estrazione del DNA

1. Rimuovere delicatamente la fase acquosa depositata sopra l’interfase e scartarla. Per ottenere la precipitazione del DNA dall’interfase e dalla fase organica, aggiungere 0,3 mL di etanolo 100% per 1 mL del TRI Reagent usato nel paragrafo Preparazione del campione, passaggio 1. Miscelare per inversione e lasciar riposare per 2–3 minuti a temperatura ambiente. Centrifugare a 2.000× g per 5 minuti a 2–8 °C.

Nota: la rimozione della fase acquosa rimanente prima della precipitazione del DNA è un passaggio cruciale da cui dipende la qualità del DNA isolato.

2. Rimuovere il surnatante e conservarlo 2–8 °C per il successivo isolamento delle proteine. Lavare due volte il pellet del DNA in una soluzione di citrato trisodico 0,1 M con etanolo al 10%. Usare 1 mL di soluzione di lavaggio per 1 mL del TRI Reagent usato nel paragrafo Preparazione del campione, passaggio 1. Nel corso di ogni lavaggio, lasciar riposare il pellet del DNA (miscelando di tanto in tanto) per almeno 30 minuti. Centrifugare a 2.000 × g per 5 minuti a 2–8 °C. Risospendere il pellet del DNA in etanolo 75% (1,5-2 mL per 1 mL di TRI Reagent) e lasciar riposare per 10–20 minuti a temperatura ambiente.

N.B.

• Importante: non ridurre la durata della permanenza del campione nella soluzione di lavaggio. Per un’efficace rimozione del fenolo dal DNA, trenta minuti sono il tempo minimo assoluto necessario.
• Se il pellet contiene >200 mg di DNA o grandi quantità di materiale di altro tipo, è necessario un lavaggio aggiuntivo con la soluzione di citrato trisodico 0,1 M contenente etanolo al 10%.
• I campioni sospesi in etanolo 75% possono essere conservati a 2–8 °C per molti mesi.

3. Essiccare il pellet del DNA per 5–10 minuti con il vuoto e disciogliere in NaOH 8 mM pipettando lentamente più volte con una micropipetta. Aggiungere una quantità sufficiente di NaOH 8 mM per ottenere una concentrazione finale di DNA di 0,2–0,3 mg/mL (tipicamente 0,3–0,6 mL per DNA isolato da 50–70 mg di tessuto o da 10⁷ cellule). Questa soluzione blandamente alcalina garantisce il dissolvimento completo del pellet del DNA. Centrifugare a 12.000 × g per 10 minuti per rimuovere tutto il materiale insolubile e trasferire il surnatante in una provetta nuova.

Nota:

• un surnatante viscoso indica la presenza di DNA di massa molecolare elevata.
• Le dimensioni del DNA dipendono dalla forza esercitata durante l’omogeneizzazione. Non utilizzare un omogeneizzatore Polytron.
• I campioni dissolti in NaOH 8 mM possono essere conservati a 2–8 °C per una notte. Se vanno conservati più a lungo, correggere il pH portandolo a un valore compreso tra 7 e 8 e aggiungere EDTA (concentrazione finale 1 mM).
• Per determinare la concentrazione del DNA, prelevare un’aliquota, diluirla con acqua e misurare l’assorbanza alla lunghezza d’onda di 260 nm (A260). Per il DNA a doppio filamento, 1 unità di A260/mL equivale a una concentrazione di DNA pari a 50 µg/mL.
• Per calcolare il numero di cellule, si assume che la quantità di DNA presente in 10⁶ cellule diploidi di uomo, ratto e topo sia rispettivamente pari a 7,1 µg, 6,5 µg e 5,8 µg.
• Rese ottenute tipicamente da tessuti (µg DNA/mg tessuto): fegato, rene, 3–4 µg; muscolo scheletrico, cervello e placenta, 2–3 µg.
• Rese ottenute tipicamente da cellule di uomo, ratto e topo in coltura: 5–7 µg DNA/10⁶ cellule.

Amplificazione del DNA mediante PCR

Dopo dissoluzione in NaOH 8 mM, portare a pH 8,4 con HEPES (aggiungere 86 µL di HEPES 0,1 M, acido libero/mL di soluzione di DNA). Aggiungere il campione (solitamente 0,1–1 µg) alla miscela della PCR e seguire il Protocollo di PCR.

Digestione del DNA con enzimi di restrizione

Correggere il pH della soluzione di DNA portandolo al valore adatto alla digestione con enzimi di restrizione con HEPES, oppure dializzare i campioni contro EDTA 1 mM, pH 7–8. Lasciar proseguire la digestione con gli enzimi di restrizione per 3–24 ore in condizioni ottimali. Si raccomanda di usare 3–5 unità di enzimi di restrizione per 1 µg di DNA. Solitamente viene digerito l’80–90% del DNA.

Isolamento delle proteine

1. Far precipitare le proteine (vedere la nota) dal surnatante fenolo-etanolo (paragrafo Isolamento del DNA, passaggio 2) con 1,5 mL di 2-propanolo per 1 mL del TRI Reagent usato nel paragrafo Preparazione del campione, passaggio 1. Lasciar riposare il campione per almeno 10 minuti a temperatura ambiente. Centrifugare a 12.000× g per 10 minuti a 2–8 °C.

Nota: con alcuni campioni potrebbe risultare difficile dissolvere il pellet delle proteine con SDS 1% (passaggio 3). In tal caso, attenersi alla procedura indicata di seguito.

• Dializzare il surnatante fenolo-etanolo contro SDS 0,1% a 2–8 °C per 3 volte.
• Centrifugare il dialisato a 10.000× g per 10 minuti a 2–8 °C.
• Il surnatante limpido contiene proteine utilizzabili nelle procedure di Western blotting.

2. Scartare il surnatante e lavare il pellet per 3 volte con cloridrato di guanidina 0,3 M in etanolo 95%, utilizzando 2 mL per 1 mL del TRI Reagent usato nel paragrafo Preparazione del campione, passaggio 1. Durante ogni lavaggio, lasciare il campione nella soluzione di lavaggio per 20 minuti a temperatura ambiente. Centrifugare a 7.500 × g per 5 minuti a 2–8 °C. Dopo i 3 lavaggi, aggiungere 2 mL di etanolo 100% e vortexare il pellet delle proteine. Lasciar riposare per 20 minuti a temperatura ambiente. Centrifugare a 7.500× g per 5 minuti a 2–8 °C.

Nota: i campioni sospesi in cloridrato di guanidina 0,3 M in etanolo 95% o in etanolo 100% possono essere conservati per 1 mese a 2–8 °C o per 1 anno a –20 °C.

3. Essiccare il pellet delle proteine per 5– 10 minuti mediante vuoto. Dissolvere il pellet in SDS 1% aiutandosi azionando lo stantuffo del micropipettatore mentre si mantiene il puntale immerso nella soluzione. Asportare tutto il materiale insolubile centrifugando a 10.000 × g per 10 minuti a 2–8 °C. Trasferire il surnatante in una provetta nuova. La soluzione delle proteine va usata subito nel saggio di Western blotting oppure conservata a –20 °C.

Risoluzione dei problemi

1. Isolamento dell’RNA

A. Cause di una bassa resa:

• il campione non è stato omogeneizzato completamente oppure si è verificata la lisi del campione;
• il pellet finale dell’RNA non è stato dissolto completamente.

B. Rapporto A260 / A280 <1,65:

• la quantità di campione usato per l’omogeneizzazione era troppo scarsa;
• il campione non è stato lasciato riposare a temperatura ambiente per 5 minuti dopo l’omogeneizzazione;
• la fase acquosa è stata contaminata dalla fase fenolica;
• il pellet finale dell’RNA non è stato dissolto completamente.

C. Degradazione dell’RNA:

• il tessuto non è stato processato o congelato immediatamente dopo il prelievo dall’animale;
• il campione usato per l’isolamento o la preparazione dell’RNA isolato sono stati conservati a –20 °C invece che a –70 °C come specificato nella procedura;
• le cellule sono state distaccate mediante digestione con tripsina;
• le soluzioni acquose o le provette usate per la procedura non erano prive di RNasi;
• il pH della formaldeide usata per l’elettroforesi su gel di agarosio era <3,5.

C. Contaminazione con DNA:

• il volume di reagente usato per l’omogeneizzazione del campione era troppo scarso;
• il campione usato per l’isolamento conteneva solventi organici (etanolo, DMSO), tamponi forti o soluzione alcalina.

2. Isolamento del DNA

A. Cause di una bassa resa:

• il campione non è stato omogeneizzato completamente oppure si è verificata la lisi del campione;
• il pellet finale del DNA non è stato dissolto completamente.

B. Rapporto A260 / A280 <1,70:

• il fenolo non è stato sufficientemente rimosso dalla preparazione del DNA. Provare a lavare ancora una volta il pellet del DNA con la soluzione di citrato trisodico 0,1 M ed etanolo 10%.

C. Degradazione del DNA:

• il tessuto non è stato processato o congelato immediatamente dopo il prelievo dall’animale;
• il campione usato per l’ isolamento è stato conservato a –20 °C invece che a –70 °C come specificato nella procedura;
• il campione è stato omogeneizzato con un omogeneizzatore ad alta velocità Polytron o di altro tipo.

C. Contaminazione con RNA:

• è rimasta troppa fase acquosa insieme alla fase organica e all’interfase;
• il pellet del DNA non è stato lavato sufficientemente con la soluzione di citrato trisodico 0,1 M ed etanolo al 10%.

3. Isolamento delle proteine

A. Cause di una bassa resa:

• il campione non è stato omogeneizzato completamente oppure si è verificata la lisi del campione;
• il pellet finale delle proteine non è stato dissolto completamente.

B. Degradazione delle proteine:

• il tessuto non è stato processato o congelato immediatamente dopo il prelievo dall’animale.

C. Banda deformata sul gel PAGE :

• il pellet delle proteine non è stato lavato sufficientemente.

Appendice

I. Isolamento dell’RNA con coda di poli-A+
Dopo aver ottenuto la precipitazione dell’RNA con il 2-propanolo (paragrafo Isolamento dell’RNA, passaggio 1), dissolvere il pellet nel tampone di binding per poli-A+ e far passare la soluzione attraverso una colonna di oligo‑dT e cellulosa per rimuovere selettivamente l’mRNA secondo la procedura di Aviv e Leder.³

II. Utilizzo dell’RNA isolato nella procedura di RT-PCR

1. Se si aggiunge un’ulteriore centrifugazione a quella indicata al paragrafo iniziale Preparazione del campione, passaggio 1B, nota al punto C, si riduce ulteriormente la possibilità che del DNA contamini l’RNA estratto con il TRI Reagent.

2. Se il campione di RNA viene poi usato per una RT-PCR, è necessario che l’etanolo sia evaporato del tutto. Ciò risulta particolarmente importante per campioni di volume scarso (5–20 μL), che, se non vengono essiccati adeguatamente, possono contenere una quantità relativamente elevata di etanolo.

Bibliografia

1. Chomczynski P. 1993. A reagent for the single-step simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from cell and tissue samples. Biotechniques. 15(3):536-7.

2. Chomczynski P, Sacchi N. 1987. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical Biochemistry. 162(1):156-159. https://doi.org/10.1016/0003-2697(87)90021-2

3. Aviv H, Leder P. 1972. Purification of Biologically Active Globin Messenger RNA by Chromatography on Oligothymidylic acid-Cellulose. Proceedings of the National Academy of Sciences. 69(6):1408-1412. https://doi.org/10.1073/pnas.69.6.1408

4. Chomczynski P, Mackey K. 1995. Substitution of Chloroform by Bromochloropropane in the Single-Step Method of RNA Isolation. Analytical Biochemistry. 225(1):163-164. https://doi.org/10.1006/abio.1995.1126