Sequenziamento con metodo Sanger, procedura e passaggi

Che cos’è il sequenziamento secondo Sanger?

Il sequenziamento secondo Sanger, detto anche “metodo di terminazione della catena”, è una tecnica che permette di determinare la sequenza nucleotidica di un DNA. Il metodo prende il nome dal suo ideatore, il due volte premio Nobel Frederick Sanger, che lo sviluppò insieme ai suoi colleghi nel 1977.

Per maggiori informazioni sulla struttura generale del DNA, vedi la Figura 2.

Come funziona il sequenziamento secondo Sanger?

Questo tipo di sequenziamento è eseguibile sia manualmente che, più comunemente, in modo automatico con uno strumento apposito (Figura 1). In ogni caso, i passaggi fondamentali, descritti sotto, sono tre.

Figura 1. I tre passaggi fondamentali del sequenziamento automatico secondo Sanger

Passaggi del sequenziamento secondo Sanger

Per ottenere il sequenziamento del DNA con il metodo di Sanger i passaggi principali sono tre.

1. Sequenza di DNA da sottoporre a PCR con terminazione della catena

La sequenza di DNA di interesse viene usata come stampo per un tipo speciale di PCR chiamata PCR con terminazione della catena, che funziona come una PCR standard tranne che per una differenza fondamentale: l’aggiunta di nucleotidi (dNTP) modificati chiamati didesossiribonucleotidi (ddNTP). Durante la fase di estensione della PCR standard, la DNA polimerasi aggiunge i dNTP al filamento di DNA crescente catalizzando la formazione di un legame fosfodiesterico tra il gruppo 3’-OH libero dell’ultimo nucleotide e il gruppo 5’-fosfato del successivo (Figura 2).

Nella PCR con terminazione della catena, si utilizza una miscela costituita dai normali dNTP insieme a una bassa concentrazione di ddNTP. Poiché i ddNTP sono privi del gruppo 3'-OH necessario per la formazione de legame fosfodiesterico, quando la DNA polimerasi incorpora casualmente un ddNTP, l’estensione cessa. Il risultato di questo tipo di PCR è rappresentato da milioni fino a miliardi di oligonucleotidi che sono copie della sequenza di DNA di interesse ma che terminano a una lunghezza casuale (n) con un 5’-ddNTP.

Nel sequenziamento con metodo Sanger di tipo manuale, si allestiscono 4 reazioni di PCR, ciascuna con l’aggiunta di un solo tipo di ddNTP (ddATP, ddTTP, ddGTP e ddCTP).

Invece, nel sequenziamento automatico si aggiungono tutti i ddNTP nella stessa miscela di reazione, ognuno legato a un marcatore fluorescente diverso.

2. Elettroforesi su gel per la separazione su base dimensionale

Nel secondo passaggio, gli oligonucleotidi a catena tronca vengono separati in base alle dimensioni grazie all’elettroforesi su gel. I campioni vengono perciò caricati a un’estremità della matrice di gel, a cui viene poi applicata una corrente elettrica. Il DNA è carico negativamente, quindi gli oligonucleotidi saranno attratti verso l’elettrodo positivo che si trova all’estremità opposta del gel. Dato che tutti i frammenti di DNA presentano la stessa carica per unità di massa, la velocità alla quale si muovono gli oligonucleotidi dipende solo dalle loro dimensioni. Più il frammento è piccolo, meno resistenza incontrerà spostandosi nel gel e quindi più velocemente avanzerà, con il risultato che i frammenti si ordineranno dai più piccoli ai più grandi leggendo il gel dal basso verso l’alto.

Nel sequenziamento manuale, gli oligonucleotidi ottenuti da ciascuna delle quattro reazioni di PCR vengono aggiunti a quattro diverse corsie di un gel, così è noto quali oligonucleotidi corrispondono a ciascun ddNTP.

Nel sequenziamento automatico, tutti gli oligonucleotidi vengono sottoposti a corsa elettroforetica su un unico gel capillare all’interno dell’apparecchiatura di sequenziamento.

3. Analisi del gel e determinazione della sequenza di DNA

L’ultimo passaggio prevede la lettura del gel per determinare la sequenza del DNA in esame. Dato che la DNA polimerasi sintetizza il DNA solo nella direzione da 5’ a 3’ a partire da un primer fornito, ogni ddNTP terminale corrisponderà a uno specifico nucleotide nella sequenza originale (per es., il frammento più corto deve terminare a livello del primo nucleotide a partire dall’estremità 5’, il secondo frammento più corto deve terminare a livello del secondo nucleotide a partire dall’estremità 5’ e così via). Pertanto, leggendo le bande del gel dalla più piccola alla più grande è possibile determinare la sequenza da 5’ a 3’ del filamento di DNA di partenza.

Nel sequenziamento manuale si leggono tutte e quattro le corsie del gel contemporaneamente, spostandosi dal basso verso l’alto, e utilizzando la corsia per determinare l’identità del ddNTP terminale di ogni banda. Per esempio, se la banda più in basso è presente nella colonna che corrisponde al ddGTP, allora il frammento più piccolo della PCR termina con ddGTP e il primo nucleotide a partire dall’estremità 5’ della sequenza di partenza corrisponde a una guanina (G).

Nel sequenziamento automatico, un computer legge tutte le bande del gel capillare, in ordine, usando la fluorescenza per assegnare l’identità di ogni ddNTP terminale (le cosiddette “call”). In breve, un laser eccita i “tag” (marcatori) fluorescenti di ciascuna banda e un computer rileva la risultante luce emessa. Dato che ognuno dei quattro ddNTP è dotato di un “tag” fluorescente diverso, la luce emessa è indicativa dell’identità del ddNTP terminale. Si ottiene così un cromatogramma, dove è mostrato il picco di fluorescenza di ogni nucleotide lungo la catena del DNA stampo.

Figura 2. Schematizzazione della struttura del DNA. Il DNA è una molecola composta da due filamenti che si avvolgono l’uno sull’altro formando una doppia elica. Ogni filamento è composto da una stringa di molecole chiamate desossiribonucleotidi (dNTP).

Ciascun dNTP contiene un gruppo fosfato, uno zucchero e una delle quattro basi azotate: adenina (A), timina (T), guanina (G) o citosina (C). I dNTP sono concatenati linearmente attraverso legami covalenti fosfodiesterici tra lo zucchero di un dNTP e il gruppo fosfato del successivo; queste unità ripetute zucchero-fosfato vanno a costituire la struttura portante del DNA.

I due filamenti opposti che formano la doppia elica del DNA sono mantenuti appaiati grazie ai legami idrogeno che si formano tra basi azotate complementari.

Come leggere i risultati del sequenziamento con metodo Sanger

La lettura corretta del sequenziamento secondo Sanger dipende da quale dei due filamenti complementari di DNA è di interesse e da quale primer è disponibile. Se i due filamenti di DNA sono A e B e il filamento A è quello di interesse ma il primer è più adatto al filamento B, i frammenti ottenuti (output) saranno identici al filamento A. Di contro, se è il filamento A quello di interesse e il primer è più adatto al filamento A, allora l’output sarà identico al filamento B. E, di conseguenza, l’output andrà poi riconvertito nel filamento A.

Quindi, se la sequenza di interesse è “TACG” e il primer è più adatto a quel filamento, l’output sarà “ATGC” e, quindi, va riconvertito in “TACG”. Tuttavia, se il primer è più adatto al filamento complementare (“ATGC”), allora l’output sarà “TACG”, che è la sequenza corretta.

Quindi, in poche parole, è indispensabile conoscere qual è il proprio obiettivo e come fare per raggiungerlo! Tenendo a mente quanto sopra, facciamo un esempio del caso appena descritto (TACG -> ATGC -> TACG). Se i “tag” dei didesossinucleotidi sono T = giallo, A = rosa, C = blu scuro e G = blu chiaro, si otterranno le sequenze brevi primer-A, primer-AT, primer-ATG e primer-ATGC. Dopo la separazione dei frammenti su gel elettroforesi, il laser leggerà i frammenti in ordine di lunghezza (rosa, giallo, blu chiaro e blu scuro) ed elaborerà un cromatogramma. Il computer convertirà i segnali in lettere, quindi la sequenza finale sarà correttamente TACG.

Sequenziamento con metodo Sanger vs. PCR

Il sequenziamento con metodo Sanger e la PCR si avvalgono degli stessi materiali di partenza e possono essere usati congiuntamente, ma non singolarmente.

Infatti la PCR si usa per amplificare il DNA nella sua interezza. Sebbene si possano generare accidentalmente anche frammenti di svariate lunghezze (per es., la DNA polimerasi potrebbe staccarsi), l’obiettivo è duplicare l’intera sequenza di DNA. A tal fine, gli “ingredienti” sono il DNA target, i nucleotidi, il primer a DNA e la DNA polimerasi (nella fattispecie, la Taq polimerasi, che funziona alle alte temperature richieste dalla PCR).

Al contrario, nel sequenziamento con metodo Sanger lo scopo è generare oligonucleotidi di tutte le lunghezze possibili, dalla più corta fino a quella più lunga e completa del DNA target. Ecco perché, oltre ai materiali di partenza per la PCR, sono necessari anche i didesossinucleotidi.

Il sequenziamento con metodo Sanger e la PCR possono essere abbinati quando si genera il materiale di partenza per un protocollo di sequenziamento secondo Sanger. La PCR può servire a creare molte copie del DNA da sequenziare.

Disporre di più di uno stampo da cui partire può rendere più efficiente il protocollo di Sanger. Se la sequenza target è lunga 1.000 nucleotidi ed è disponibile una sola copia dello stampo, sarà necessario molto tempo per generare i 1.000 frammenti dotati di tag. Invece se sono disponibili molte copie dello stampo, in teoria servirà meno tempo per generarli.