Metodo standard raccomandato per isolare le cellule mononucleate

La separazione delle cellule utilizzando i prodotti Ficoll-Paque può essere ottenuta con un ampio intervallo di volumi di campioni ematici. Vista l’elevata resa, questo metodo può essere adattato alla lavorazione di quantità molto piccole di sangue, come nel caso di sangue prelevato da bambini. Affinché la riproducibilità della separazione sia massima, si raccomanda di attenersi a una procedura standardizzata. La procedura che segue è stata valutata dai nostri laboratori utilizzando il prodotto Ficoll-Paque PLUS ed è raccomandata per la separazione di campioni ematici normali. Per adattarla a un particolare sistema di centrifugazione si possono facilmente apportare piccole modifiche. La procedura descritta è raccomandata anche quando si separano le cellule usando i prodotti Ficoll-Paque PREMIUM, Ficoll-Paque PREMIUM 1.084 e Ficoll-Paque PREMIUM 1.073.

Per standardizzare la tecnica, per prima cosa vanno scelti il volume di sangue e il diametro della provetta da centrifuga. Questi fattori determinano l’altezza del campione di sangue nella provetta e, di conseguenza, la durata della centrifugazione. Più l’altezza del campione di sangue nella provetta è alta, maggiore è la contaminazione da eritrociti. Invece la separazione non è influenzata apprezzabilmente dal variare del diametro della provetta. Perciò, si può separare con lo stesso grado di purificazione un volume maggiore all’interno di una provetta di diametro più ampio mantenendo costanti l’altezza del campione di sangue nella provetta e la durata della centrifugazione.

La resa e il grado di purezza delle cellule mononucleate dipendono prevalentemente dall’efficienza di rimozione degli eritrociti.

Se gli eritrociti nel sangue intero sono aggregati, alcune cellule mononucleate possono essere intrappolate all’interno di questi ultimi e quindi co-sedimentare. Un modo per limitare la tendenza a intrappolare le cellule mononucleate è quello di diluire il sangue. La diluizione aumenta la resa di cellule mononucleate e riduce le dimensioni degli aggregati eritrocitari. L’aggregazione degli eritrociti è amplificata quando il sangue è esposto a temperature elevate (37 °C), con conseguente minor resa di cellule mononucleate. Tuttavia, a temperature inferiori (4 °C), l’aggregazione diminuisce ma il tempo di separazione aumenta, fattore anch’esso che diminuisce la resa di cellule mononucleate. Per risultati ottimali la temperatura deve rimanere tra i 18 °C e i 20 °C.

Attrezzature e soluzioni necessarie ma non fornite

1. Soluzione salina bilanciata sterile o altre soluzioni saline standard (si veda Preparazione dei reagenti).
2. Centrifuga con rotore basculante (con freno rotore disattivato).
3. Provette per centrifuga e pipette sterili.
4. Aghi e siringhe sterili.
5. Soluzione a scelta per la lisi degli eritrociti (se si isolano i granulociti).

Preparazione dei reagenti

Diluente e soluzione di lavaggio
La soluzione salina bilanciata per la diluizione del sangue e il lavaggio delle cellule si può preparare secondo le istruzioni indicate sotto. Si possono utilizzare anche altri diluenti e liquidi di lavaggio, come il tampone fosfato salino senza Ca²⁺/Mg²⁺ (per es., PBS di Dulbecco), soluzioni saline (per es., quella di Hank) o terreni per colture cellulari (per es., RPMI 1640).

Soluzione salina bilanciata
Per preparare la soluzione salina bilanciata, miscelare un volume di soluzione madre A con nove volumi di soluzione madre B e sterilizzare. Il volume di lavoro di ogni campione deve essere almeno pari a 20 mL. Si possono utilizzare anche altre soluzioni saline standard sterili.

Soluzione A	Concentrazione (M)	Concentrazione (g/L)
D-glucosio anidro	5,5 × 10-3 M (0,1%)	1,0
CaCl2.2H2O	5,0 × 10-5 M	0,0074
MgCl2.6H20	9,8 × 10-4 M	0,1992
KCl	5,4 × 10-3 M	0,4026
TRIS	0,145 M	17,565

Sciogliere in circa 950 mL di acqua distillata e aggiungere HCl concentrato fino a pH 7,6, quindi portare il volume a 1 L.

Soluzione B	Concentrazione (M)	Concentrazione (g/L)
NaCl	0,14	8,19

Per preparare la soluzione salina bilanciata, miscelare 1 volume di soluzione A con 9 volumi di soluzione B. La soluzione va preparata fresca tutte le settimane. Si possono utilizzare altre soluzioni saline standard.

Prodotto Ficoll-Paque
Prima dell’uso, riscaldare il mezzo a gradiente di densità Ficoll-Paque a 18-20 °C. Per volumi di campione superiori a 3 mL, consultare le Note.

Preparazione del campione
Per garantire un’elevata vitalità delle cellule mononucleate isolate si deve utilizzare sangue fresco. Preparare il campione a 18-20 °C.

1. A una provetta da centrifuga da 10 mL, aggiungere 2 mL di sangue trattato con anticoagulante o defibrinato e un egual volume di soluzione salina bilanciata (volume finale: 4 mL).
2. Miscelare sangue e tampone capovolgendo la provetta molte volte oppure aspirando e rilasciando la miscela con una pipetta.

Procedura per isolare le cellule mononucleate

1. Capovolgere molte volte la bottiglia di Ficoll-Paque per assicurarsi che il mezzo sia ben miscelato.
   Se Ficoll-Paque viene prelevato con siringa: staccare il tappo di polipropilene e inserire l'ago della siringa attraverso il setto (Figura 1).
   Se Ficoll-Paque viene prelevato con pipetta: staccare il tappo di polipropilene. Sollevare l’anello di alluminio. Strappare il sigillo di metallo. Rimuovere l’anello argentato.
   Rimuovere la chiusura di gomma. Con tecnica asettica, prelevare il volume di Ficoll-Paque necessario (Figura 2).
2. Aggiungere il mezzo Ficoll-Paque (3 mL) alla provetta da centrifuga.
3. Depositare con cautela il campione di sangue diluito (4 mL) sopra la soluzione di Ficoll-Paque (Figura 3).
   Importante: quando si deposita il campione di sangue diluito, non miscelarlo con la soluzione di Ficoll-Paque.
4. Centrifugare a 400 g per 30-40 minuti a 18-20 °C (con freno rotore disattivato).
5. Con una pipetta sterile, aspirare lo strato superiore che contiene plasma e piastrine, senza disturbare l’interfaccia costituita dallo strato di cellule mononucleate (Figure 4 e 5). Lo strato superiore, che contiene il plasma, può essere conservato per usi futuri.
6. Trasferire lo strato di cellule mononucleate in una provetta da centrifuga sterile utilizzando una pipetta sterile.

Figura 1. Rimozione del tappo di polipropilene e dell’anello argentato.

Figura 2. Prelievo del mezzo Ficoll-Paque.

Figura 3. Campione di sangue stratificato sopra il mezzo Ficoll-Paque.

Figura 4. Prima della rimozione dello strato superiore.

Figura 5. Dopo la rimozione dello strato superiore (plasma).

Lavaggio dello strato di cellule isolato

1. Stimare il volume delle cellule mononucleate trasferite. Aggiungere almeno 3 volumi (circa 6 mL) di soluzione salina bilanciata alle cellule mononucleate trasferite nella provetta da centrifuga.
2. Sospendere le cellule aspirando e rilasciando delicatamente con la pipetta.
3. Centrifugare a 400-500 × g per 10-15 minuti a 18–20 °C.

Nota: la centrifugazione ad alta velocità aumenta il recupero di cellule mononucleate. Se tuttavia è importante eliminare anche le piastrine, si raccomanda una velocità di centrifugazione più bassa (60-100 x g).

1. Rimuovere il surnatante.
2. Sospendere le cellule mononucleate in 6-8 mL di soluzione salina bilanciata.
3. Centrifugare a 400-500 × g (o a 60-100 x g per rimuovere la piastrine) per 10 minuti a 18–20 °C.
4. Rimuovere il surnatante.
5. Risospendere il pellet cellulare in un terreno adatto al tipo di applicazione.

Procedura per isolare i granulociti

1. Procedere alla centrifugazione in gradiente di densità con mezzo Ficoll-Paque come descritto sopra al paragrafo Procedura per isolare le cellule mononucleate, punti da 1 a 6.
2. Con una pipetta sterile, aspirare lo strato superiore di Ficoll-Paque, senza disturbare lo strato leucocitario di granulociti che si trova al di sopra dello strato di eritrociti.
3. Con una pipetta, prelevare il sottile strato leucocitario di granulociti e trasferirlo in una provetta da centrifuga sterile.
4. Risospendere le cellule in almeno 5 volumi di soluzione salina bilanciata e centrifugare a 400 × g per 15 min.
5. Lisare gli eritrociti rimasti con una soluzione di lisi eritrocitaria a scelta.
6. Centrifugare i granulociti a 400-500 × g per 10-15 minuti a 18–20 °C.
7. Rimuovere il surnatante.
8. Risospendere i granulociti in 6-8 mL di soluzione salina bilanciata.
9. Centrifugare a 400-500 × g per 10 minuti a 18–20 °C.
10. Rimuovere il surnatante.
11. Risospendere il pellet cellulare in un terreno adatto al tipo di applicazione.

Note
Anticoagulanti: come anticoagulante per il campione di sangue si può utilizzare eparina, EDTA, ACD (citrato destrosio) o CPD (citrato fosfato destrosio). Il sangue defibrinato non richiede anticoagulante. Tuttavia la defibrinazione riduce la resa di cellule mononucleate e può incrementare la contaminazione da parte di eritrociti.³ Causa anche la perdita selettiva di monociti.

Bøyum ha riscontrato che si ottiene una preparazione di cellule mononucleate più pura se si usa come anticoagulante l’EDTA invece dell’eparina.³ È stato anche notato che se le cellule mononucleate vengono purificate da fonti diverse dal sangue periferico, l’aggiunta di eparina può indurre la gelificazione delle sospensioni cellulari.⁴ Se il sangue viene stabilizzato con citrato si possono ottenere RNA e DNA di qualità migliore rispetto a quando si usano altri anticoagulanti, con una resa maggiore di cellule mononucleate. L’eparina influisce sulla proliferazione dei linfociti T e si lega a molte proteine. L’EDTA è adatto ai saggi basati sul DNA, tuttavia influenza la concentrazione di Mg2+ e causa problemi nelle analisi citogenetiche.⁵ È stato inoltre dimostrato che la resa dell’RNA è superiore se si usa sangue con EDTA rispetto a quella ottenuta con il sangue eparinizzato.⁶

Volume di sangue: si possono processare volumi di sangue maggiori ottenendo la stessa efficienza di separazione se si usano provette da centrifuga di diametro maggiore e si mantiene circa la stessa altezza del mezzo Ficoll-Paque (2,4 cm) e di campione ematico (3,0 cm) come nella procedura standard descritta sopra. L’incremento del diametro della provetta non influisce sul tempo necessario per la separazione.

Conservazione dei campioni di sangue: per risultati ottimali, i campioni ematici non devono contenere coaguli e devono essere lavorati il prima possibile dopo il prelievo. Qualsiasi ritardo può causare la perdita di vitalità cellulare, un minor numero di cellule recuperate e più granulociti e/o eritrociti contaminanti. È stato infatti riportato che mantenendo il sangue per 24 ore a temperatura ambiente si è ottenuta una resa minore di linfociti, un’alterata espressione dei marcatori di superficie e una minor risposta alla stimolazione con mitogeni.^5,7,8 Rimozione delle cellule morte: le cellule morte vengono rimosse durante l’isolamento delle cellule con Ficoll-Paque PLUS.^9,10,58

Densità e temperatura: la temperatura alla quale si effettuano le separazioni in gradiente di densità è ovviamente influenzata dalla temperatura dell’ambiente, della centrifuga, del mezzo a gradiente di densità e del campione liquido. Talvolta non è chiaro che cosa si intende con temperatura ambiente (per es., in Europa può essere 20 ºC mentre in Nord America >20 ºC). È noto che la densità dei prodotti Ficoll-Paque diminuisce al crescere della temperatura. Per esempio, la densità di Ficoll-Paque PREMIUM (1,077 g/mL) a 20 ºC, 22 ºC e 25 ºC è rispettivamente di 1,0772, 1,0767 e 1,0758.

Campioni ematici patologici: la procedura standard descritta sopra è stata ottimizzata per la purificazione di cellule mononucleate da sangue periferico di donatori umani normali, ossia sani. I risultati potrebbero essere diversi quando i campioni provengono da donatori con malattie infettive o altre patologie, come il cancro (si veda il Manuale “Isolation of mononuclear cells” al paragrafo “Further applications of Ficoll-Paque PLUS and Ficoll-Paque PREMIUM”, pagina 15).

Rimozione delle piastrine: se è importante rimuovere tutte le piastrine della frazione delle cellule mononucleate, si può procedere a una seconda centrifugazione in gradiente di saccarosio dal 4% al 20% stratificato su Ficoll-Paque PLUS. Questo passaggio è molto efficace per rimuovere tutte le piastrine contaminanti.¹¹ Le piastrine rimangono nella parte superiore del gradiente di saccarosio e le cellule mononucleate si sedimentano lungo il gradiente di saccarosio fino alla parte superiore dello strato di Ficoll-Paque. In alternativa, le piastrine possono essere rimosse tramite aggregazione con adenosina-5’-difosfato (ADP) prima di separare le cellule mononucleate.¹²

Che cosa fare se le prestazioni non sono adeguate
Se ci si attiene alla procedura standard raccomandata, l’isolamento delle cellule mononucleate da sangue periferico umano con Ficoll-Paque PLUS e Ficoll-Paque PREMIUM dovrebbe avvenire senza problemi, con risultati simili a quelli elencati alla pagina 4 del Manuale “Isolation of mononuclear cells”. Come menzionato prima, Ficoll-Paque PREMIUM 1.073 e Ficoll-Paque PREMIUM 1.084 permettono di isolare preparazioni di cellule caratterizzate da sottogruppi di cellule mononucleate di densità leggermente diversa. Tuttavia, se si devia da determinati parametri sperimentali si possono compromettere i risultati. Perciò di seguito è riportata una tabella che aiuta a identificare e correggere rapidamente il problema che riduce le prestazioni.

Deviazione dalle prestazioni previste	Probabile causa	Commenti
Aumento degli eritrociti e contaminazione con linfociti.	A. Temperatura troppo bassa.	A temperature basse la densità di tutti i prodotti Ficoll-Paque è più elevata (si veda Note, Densità e temperatura) e gli eritrociti si aggregano con minore efficacia, quindi, insieme ai granulociti, non riescono a entrare nello strato del mezzo Ficoll-Paque. Portare la temperatura a 18-20 °C.
	B. Velocità di centrifugazione troppo bassa e/o durata di centrifugazione troppo breve.	Per garantire la sedimentazione completa delle cellule non linfoidi, il tempo di centrifugazione e la forza g devono essere adeguati.
Bassa resa e vitalità delle cellule mononucleate.	Temperatura troppo alta.	A temperature alte la densità dei prodotti Ficoll-Paque è più bassa e alcuni linfociti possono penetrare nello strato del mezzo Ficoll-Paque. Anche la vitalità cellulare può risultare compromessa dalla temperatura elevata. Ridurre la temperatura a 18-20 °C.
Bassa resa di cellule mononucleate con vitalità normale.	Sangue non diluito 1:1 con la soluzione salina bilanciata; ematocrito insolitamente alto.	L’alta densità cellulare fa sì che molti linfociti rimangano intrappolati negli aggregati di eritrociti. Diluire ulteriormente il campione ematico.
Bassa resa di cellule mononucleate con più granulociti contaminanti.	Le vibrazioni del rotore della centrifuga causano l’agitazione del gradiente.	Le vibrazioni possono causare l’ampliamento della banda delle cellule mononucleate, che si mescolano alle cellule dello strato sottostante. Accertarsi che il rotore sia correttamente bilanciato. Scegliere la velocità del rotore in modo da evitare le frequenze di risonanza naturali.
Bassa resa di cellule mononucleate, bassa vitalità e altri tipi cellulari contaminanti.	Il campione contiene cellule con densità anomala, diversa da quella delle cellule nel sangue umano normale.	Può verificarsi con campioni di sangue patologici, campioni di sangue non umano, campioni di sangue vecchi o campioni da fonti diverse dal sangue periferico. Per la separazione di campioni di questo tipo, come mezzo per la centrifugazione in gradiente di densità è più adatto Percoll™ PLUS, rispetto ai prodotti Ficoll-Paque.

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