Screening di farmaci nelle urine in tutta semplicità con la MS β-glucuronidasi: guida rapida e demo (video)
La MS β-glucuronidasi è stata specificamente ideata per le analisi automatizzate a medio e alto rendimento di campioni di urina in laboratori di tossicologia clinica e forense. Per raggiungere questo obiettivo, si è creato un prodotto pre-tamponato, stabile a temperatura ambiente e compatibile con la spettrometria di massa che consenta l’impiego di una sequenza operativa rapida, semplice e completamente automatizzata. Inoltre, questo prodotto e il suo protocollo d’impiego sono stati sviluppati di pari passo utilizzando una matrice di urina umana per essere certi di risolvere le difficoltà dovute all'attività inibitoria riscontrata nelle urine.
La MS β-glucuronidasi può essere conservata a lungo termine a 2-8 °C, oppure fino a 2 mesi a 20 °C. Inoltre, nella Master Mix l’enzima mantiene inalterata la sua attività in condizioni ambientali per almeno 7 giorni. I protocolli di seguito descritti consentono di ottenere recuperi >80% con svariati analiti, tra i quali codeina, morfina e ossimorfone (Tabella 2). Questa Guida rapida può essere adattata ad esigenze specifiche, oppure seguita tal quale per un’efficiente idrolisi dei glucuronidi in urine umane. Data la grande varietà degli strumenti di laboratorio, delle condizioni di lavoro, delle tipologie di farmaci e dei requisiti operativi, si raccomanda di verificare o convalidare l’effettiva corrispondenza dei saggi alle esigenze del ricercatore o del laboratorio analitico. Per altri reagenti e risorse, si rimanda alla pagina Enzimi per analisi farmacologiche e tossicologiche.
- Master Mix della MS β-glucuronidasi e sua preparazione
- Protocollo passo dopo passo per le analisi di routine
- Procedura di riferimento rapido per l’uso della MS β-glucuronidasi
- Effetti della procedura "Dilute and Shoot" sulla pressione della colonna
- Materiali
Master Mix della MS β-glucuronidasi e sua preparazione
Per le analisi di routine, preparare una Master Mix† come illustrato in Figura 1 e conservarla per il futuro impiego. Seguire la sequenza operativa indicata in Figura 2 per preparare i campioni di urina per le analisi. Nella Master Mix, l’enzima è stabile a temperatura ambiente fino a 40 giorni. La stabilità degli standard interni (ISD) deve essere verificata caso per caso. Prima dell’uso, lasciare che la Master Mix vada a temperatura ambiente (>20 °C).
Figura 1.Istruzioni per la preparazione di una Master Mix di MS β-glucuronidasi. Tutti i volumi possono essere proporzionalmente aumentati a seconda delle necessità. † La Master Mix non è necessaria per l’analisi di singoli campioni, per analisi occasionali o per lo sviluppo del metodo; per preparare i campioni senza ricorrere alla Master Mix, preparare una miscela di reazione come descritto in Tabella 1.
Protocollo passo dopo passo per le analisi di routine
Il seguente protocollo passo dopo passo per le analisi di routine può essere applicato a qualunque volume di urina mantenendo le dovute proporzioni.
Protocollo
- Impostare l’autocampionatore alla temperatura desiderata
- Pipettare i campioni di urina in flaconcini, piastre o colonne
- Aggiungere la Master Mix di MS β-glucuronidasi
- Trasferire i campioni nell’autocampionatoreǂ
- Dopo 16 min a 40 °C, o 30 min a 20 °C, iniettare i campioni idrolizzati
Tabella 1.Preparazione della miscela di reazione per l’analisi di un singolo campione (non serve la Master Mix). ǂ Se si ricorre alla SPE, alla filtrazione o a qualunque protocollo con un approccio diverso dal “Dilute and Shoot”, prima di continuare incubare la miscela di reazione.
Figura 2.Procedura di riferimento rapido per l’uso della MS β-glucuronidasi. Questa procedura è stata ideata pensando a un approccio “Dilute and Shoot”. Inoltre, essa può essere adattata alla SPE, alla filtrazione e ad applicazioni alternative, a seconda delle necessità.
Recuperi di campione con la procedura di riferimento rapido
Tabella 2.Esempi di recuperi di comuni analiti osservati mediante LC/MS seguendo la Guida rapida.
Andamento temporale dei recuperi nella procedura di riferimento rapido:
Figura 3.Andamento temporale dei recuperi di diversi glucuronidi idrolizzati con MS β-glucuronidasi in campioni di urina umana seguendo la procedura operativa a 40 °C (grafico a sinistra) e 20 °C (grafico a destra) come descritta nella Guida rapida.
Per ulteriori informazioni di base sull’uso della UHPLC/MS (TOF) per la determinazione di farmaci e loro metaboliti nelle urine in seguito a idrolisi enzimatica in condizioni ottimali, rimandiamo alla pagina delle risorse tecniche che propone altre risorse e altri reagenti.
Effetti della procedura "Dilute and Shoot" sulla pressione della colonna
La MS β-glucuronidasi consente l’attuazione di una procedura operativa semplificata e automatizzata per la determinazione dei farmaci nelle urine, senza necessità di incubazione in forno o di centrifugazione al termine dell’idrolisi. Nei casi in cui sia necessaria una maggiore sensibilità, è possibile aggiungere una fase di filtrazione o di estrazione dopo l’idrolisi a temperatura ambiente. Per affrontare le problematiche circa le possibili conseguenze del metodo “dilute-and-shoot” per la pressione della colonna, il nostro team di esperti ha effettuato un test seguendo il protocollo descritto nella Guida rapida della MS beta-glucuronidasi e monitorando la contropressione della colonna nel corso di ripetute iniezioni di campioni di urina umana a 20 °C (Figura 4). La procedura a 20 °C ricorre al maggior contenuto di enzima possibile e rappresenta, pertanto, lo scenario peggiore. La miscela di reazione è descritta in Tabella 3, mentre il tipo di colonna e i parametri cromatografici sono riportati in Tabella 4.
Master Mix della procedura “Dilute and Shoot”
Parametri del sistema UHPLC utilizzato per lo studio della pressione della colonna
Risultati dello studio della pressione della colonna con il protocollo d’impiego della MS β-glucuronidasi “Dilute and Shoot”
Il test prende in esame un metodo “dilute-and-shoot”. La preparazione descritta in Tabella 3 veniva iniettata direttamente in colonna, senza alcuna fase di filtrazione o SPE. Sono state effettuate 800 iniezioni ripetute nelle condizioni analitiche descritte. La contropressione, inizialmente di 140 bar, restava a livelli accettabili per la strumentazione nel corso di tutte le 800 iniezioni. Prima dell’iniezione 600, si cambiava la precolonna; tuttavia, il recupero in termini di contropressione non era completo, come illustrato nella Figura 4 che mostra l’andamento della pressione in relazione al numero di iniezioni. Benché la contropressione sia rimasta accettabile nel corso delle 800 iniezioni, è importante notare che la qualità dei cromatogrammi è diminuita considerevolmente tra le iniezioni 300 e 400 e i normali metodi di lavaggio della colonna non sono serviti a recuperare.
Andamento della pressione: AE Biphenyl - Grafico della pressione a 20 °C
Figura 4.Misura della contropressione in funzione del numero di iniezioni ripetute nelle condizioni sopra descritte. La precolonna è stata cambiata all’iniezione 600.
Considerazioni finali ricavate dallo studio della contropressione in colonna con il protocollo d’impiego della MS β-glucuronidasi “Dilute and Shoot”
La Guida rapida è stata concepita per una procedura “dilute-and-shoot”, ma può essere adattata in modo da includere fasi di filtrazione e SPE in base alle esigenze. In base alla Guida rapida, le urine vengono diluite di 10X, il che determina una riduzione dei livelli di proteine e di inibitori normalmente presenti nelle urine e contribuisce a rendere superfluo il crashing con solventi organici e la centrifugazione. Con la procedura a 20 °C, si raccomanda di sostituire la precolonna tra le iniezioni 300 e 500. È, tuttavia, importante notare che un’appropriata programmazione della manutenzione e della sostituzione è strettamente correlata al sistema e ai campioni in esame.
La decisione di ricorrere a una procedura “dilute-and-shoot” migliorerà i tempi di lavorazione diretti e i tempi di ciclo per campione, ma non costituisce necessariamente il metodo ottimale in tutti i casi. I campioni iniettati in colonna senza filtrazione o SPE sono più grezzi, il che può influire sulla durata in esercizio della colonna. Se è necessario ricorrere alla filtrazione o alla SPE, effettuare semplicemente la reazione a temperatura ambiente nel mezzo prescelto, come descritto nella Guida rapida, e continuare normalmente con l’analisi. I vantaggi di una procedura “dilute-and-shoot” sono evidenti se si prendono in esame i tempi di lavorazione diretti e indiretti per campione. Per concludere, questa è una decisione che spetta al cliente avendo come fine ultimo l’eccellenza operativa.
Procedura a 40 °C della Guida rapida per l’uso della MS β-glucuronidasi
Un metodo alternativo potrebbe essere la procedura a 40 °C della Guida rapida che ricorre a una quantità di enzima dimezzata e allo stesso fattore di diluizione per le urine. Una volta iniziata la reazione, il campione può essere caricato immediatamente nell’autocampionatore riscaldato (40 °C). Questa procedura può avere effetti benefici in termini di durata della colonna e di contropressioni rispetto al protocollo a 20 °C.
Precauzioni e limitazioni di responsabilità
Soltanto per scopi di ricerca e sviluppo. Non adatto per impieghi farmacologici, domestici o di altro genere. Per le informazioni sui pericoli e sulle procedure da adottare per una manipolazione sicura, consultare la scheda di sicurezza.
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