制药 QC 的过滤器验证研究 – 影响分析物结合的因素

• 膜过滤器吸附导致分析物损失
• 测定膜过滤器上分析物吸附情况的方法
• 影响膜过滤器药物吸附的因素
  • 分析物和膜的物理化学性质
  • 分析物浓度
  • 样品和标准品的处理条件
• 体积样品回收率
• 结论
• 产品列表

网络研讨会：LCGC 分析物结合

膜过滤器吸附导致分析物损失

许多药物QC测试（例如溶出度测试、含量均匀性、含量测定和混合均匀性等）都需要在HPLC/UHPLC分析之前对样品进行过滤。由于这些测试后的分析物定量测定至关重要，因此应使用过滤器验证研究来评估由于膜过滤器吸附所导致的分析物损失。根据膜、分析物类型、分析物浓度，不同的膜过滤器可以在不同程度上和分析物发生结合。

本研究的目的是为方法开发和验证期间的过滤器选择提供指导，特别关注分析物与注射式过滤器的结合情况。作为本研究的一部分，我们评估了以下膜和分析物特性：

• 膜的选择
• 分析物物理化学性质的影响
• 分析物浓度的影响
• 膜孔径
• 处理条件和其对分析物回收率的影响

测定膜过滤器上分析物吸附情况的方法

我们使用多种市售制剂和相应的USP专著中所述的方法进行了药物溶出度研究。我们使用了不同的注射式过滤器过滤样品并收集各级滤液。通过HPLC分析滤液以定量测量活性药物成分(API)。使用离心样品用作100%分析物回收率的对照样，以计算与针头式过滤器发生了结合的分析物。表1列出了本研究中使用的制剂。表2列出了溶出度和HPLC方法。

表1. 本研究中使用的活性物

制剂类型	活性物 (API)	分子量 (Da)	log P	pKa	BCS分类
多组分偏头痛制剂	对乙酰氨基酚	151.2	0.49	-4.4（碱性）	III
	乙酰水杨酸	180.2	1.19	3.5 (酸性)	I
	咖啡因	194.2	-0.07	14（中性）	I
止痛药	萘普生	230.3	3.18	4.1 (酸性)	II
抗胆碱能	专有化合物	480.5	3.96	8.9（碱性）	I

表2. 所研究化合物的溶出度和HPLC方法

制剂	溶出介质	HPLC 固定相	HPLC流动相	检测波长
多组分	水	L7（C8 填料）	水+乙腈+冰醋酸(69:28:3)	275
萘普生	pH 7.4 磷酸盐缓冲液，水溶液	L7（C8 填料）	乙腈+水+冰醋酸(450:540:10)	254
专有化合物	NA	L7（C8 填料）	乙腈+磷酸盐缓冲液	220

我们还对我们的一位客户所提供的均匀混合样品进行了类似的研究。我们将样品溶解在溶剂混合物中，并通过各种针头式过滤器进行过滤。对滤液进行HPLC分析，并使用以相同方式制备的标准品计算回收率。

我们通过针头式过滤器来过滤固定体积的样品，测量样品瓶中所收集的液体体积来确定各种针头式过滤器的体积样品回收率。该数值可以提供有关注射式过滤器的保留体积，及其对分析物结合所造成的影响的相关信息。

影响膜过滤器药物吸附的因素

分析物和膜的物理化学性质

分析物结合主要取决于膜和分析物的物理化学性质，因为结合是分析物和膜之间各种二次相互作用的结果。导致分析物发生结合的一些常见的次级相互作用包括：静电相互作用、氢键和疏水相互作用。

表3. 不同膜滤器从多组分偏头痛制剂中回收三种 API（对乙酰氨基酚、乙酰水杨酸和咖啡因）的回收率。

目标分析物	滤液(mL)	所用的Millex® 针头式过滤器
		亲水性PTFE	尼龙	Durapore® PVDF
对乙酰氨基酚 (278 µg/mL)	第 1 mL	110.4	58.4	109
	第 2 mL	112.3	109.3	110.6
	第 3 mL	112.2	111.3	110.8
	第 5 mL	112.2	111.5	110.7
乙酰水杨酸 (278 µg/mL)	第 1 mL	119.5	28.2	117.4
	第 2 mL	121.4	116.1	119
	第 3 mL	121.2	121.6	119.1
	第 5 mL	121.3	122	119.2
咖啡因 (72 µg/mL)	第 1 mL	114.2	106	112.2
	第 2 mL	113.9	112.6	112.6
	第 3 mL	113.8	112.9	112.7
	第 5 mL	113.6	112.9	112.7

表3显示了使用三种不同的含有亲水性 PTFE、Durapore^® PVDF 或尼龙膜的 Millex^®针头式过滤器与多组分偏头痛制剂中不同分析物的结合情况。该配方中的活性药物成分 (API) 具有不同的物理化学特性。该配方含有酸性（乙酰水杨酸）、中性（咖啡因）和碱性（对乙酰氨基酚）API。从表 3中可以看出，对乙酰氨基酚和乙酰水杨酸均与含有尼龙膜的 Millex^® 过滤器发生了牢固结合，但与含有亲水性 PTFE 或 Durapore^® PVDF 膜的 Millex^® 过滤器结合不牢固。而咖啡因并未与本研究中选择的三种膜中的任何一种发生结合。

亲水性PTFE和Durapore^® PVD膜上会与各种分析物发生相互作用的官能团都非常少，具有很低的分析物结合率，从而可以获得高回收率。尼龙膜含有氨基、羧酸官能团、酰胺键，可以通过静电和氢键相互作用与酸性或碱性分析物发生相互作用，导致分析物结合力高，回收率低。如果使用样品使针头式过滤器达到饱和状态，从而使膜上存在的结合位点均处于饱和态，即可提高尼龙针头式过滤器的分析物回收率。详情见表3中的第二个、第三个或第五个1mL滤液。

分析物浓度

在利用分析物使过滤器达到完全饱和后，即可获得定量的分析物回收率。在膜过滤器达到饱和后，分析物结合不会再发生，因为针头式过滤器的表面积有限，并且能够结合分析物的功能位点数量也有限。该饱和点取决于分析物的浓度。一般来说，随着分析物浓度的降低，过滤器完全饱和所需的体积会增加。

图1显示了分析物浓度对分析物结合，以及随后从制剂中回收萘普生的影响。我们利用亲水性PTFE Millex^®针头式过滤器过滤浓度在244ppm至2.4ppm之间的、三种不同浓度的萘普生，并通过HPLC分析滤液。结果如图1所示，即使过滤器零饱和（无废弃体积），高浓度萘普生(244ppm)也未出现分析物结合问题。在较低浓度下，由于针头式过滤器饱和不完全，前1mL滤液的回收率略低，但在第三个或第五个1mL滤液处即可获得定量回收率（表明过滤器饱和）。由于亲水性PTFE膜通常表现出较低的分析物结合力，因此这种浓度效应很微妙，但如果回收率规格要求非常严，则该问题仍然可能很明显。

图 1. 分析物浓度对分析物回收率的影响。对溶解在磷酸盐缓冲液（pH7.4）中的萘普生，使用0.45µm亲水性PTFE Millex^®针头式过滤器进行过滤。

这项研究还使用了0.2µm Millex^®亲水PTFE注射式过滤器，获得了非常相似的结果（图2）。膜孔径不会对针头式过滤器的萘普生饱和度造成显著影响，浓度效应取决于膜和分析物，因此在过滤器验证研究期间，应根据分析物浓度仔细选择废弃体积。

图 2. 分析物浓度对分析物回收率的影响。对溶解在磷酸盐缓冲液（pH7.4）中的萘普生，使用0.2µm亲水性PTFE Millex^®针头式过滤器进行过滤。

样品和标准品的处理条件

标准品和样品的处理条件会影响分析物结合情况，以及随后的分析物回收率。良好实验室实践建议您在处理样品和标准品时，应采用相同的处理方法，以避免处理条件对分析物回收率产生影响。

使用客户提供的均匀混合样品评估分析物回收率。标准品最初是使用溶解在溶剂混合物中的纯化合物制备的，均匀混合样品则溶解在相同的溶剂混合物中，然后使用Millex^® Durapore^® PVDF针头式过滤器进行过滤。在收集样品进行HPLC分析之前，应丢弃掉5mL滤液体积。我们的客户发现回收率低于预期，表明针头式过滤器处于不完全饱和状态（数据未显示）。

我们重复了这项研究，其中，样品按照原始方案进行处理，标准品使用三种不同条件进行处理：

• 标准品1：按照客户方法所制备的标准品（未过滤）。
• 标准品2：将纯化合物溶解在溶剂混合物中，然后使用各种Millex^®针头式过滤器进行过滤，并在HPLC之前（过滤）丢弃5mL滤液所制备得到的标准品。
• 标准品3：使用溶解在溶剂混合物中的混合均匀样品，在HPLC分析之前进行离心（离心样品）。

结果如表4所示。在使用标准品2进行回收率计算时，所有测试的注射式过滤器都获得了一致的定量回收率。这一点符合我们的预期，因为标准品和样品都经过了相同的处理方法，从而减少了分析物结合对回收率的影响。

表4. 处理条件对分析物回收率的影响。使用在不同条件下处理的标准品的峰面积来计算回收百分比。

使用的标准品	混合均匀样品中的回收率%
	Durapore®  PVDF Millex® 过滤器，批号1	Durapore® PVDF Millex® 过滤器，批号2	亲水性PTFE Millex® 过滤器
未过滤的标准品（标准品1）	97	98.5	100.6
过滤标准品（标准品2）	102.1	100.5	102.7
离心样品（标准品3）	95.9	97.3	99.4

另一方面，在选择标准品1或3进行回收率计算时，我们发现分析物结合会对样品回收率产生负面影响。与亲水性PTFE Millex^® 针头式过滤器相比，Millex^® Durapore^® PVDF针头式过滤器的这种效应更为明显。在使用Durapore^® PVDF针头式过滤器时，我们还观察到批次间差异性。

体积样品回收率

在大多数情况下，药物QC测试不受样品限制，体积样品回收率可能不会在很大程度上影响样品的可用性。然而，在计算分析物结合情况时，体积样品回收率起着非常重要的作用，因为在确定过滤器饱和所需的体积时，需要考虑针头过滤器的体积保留。

图3显示了在2mL水流经各种25mm和33mm针头式过滤器后，我们回收的样品体积。在我们所有测试的过滤器中，Millex^®过滤器（直径33mm）在过滤2mL水时具有最大的可回收样品量（约1.4mL），而聚丙烯膜针头式过滤器（直径25mm）仅能回收0.6mL的样品体积。该体积保留量取决于过滤器设计，其在很大程度上不受膜孔径的影响。对于测试的其他三个膜过滤器，大约有1mL的样品保留在注射式过滤器内。

图 3. 2mL水流经各种针头式过滤器后的体积回收率。亲水性PTFE Millex^®过滤器的尺寸为33mm，而所有其他针头式过滤器（来自供应商B、C、D和E）的尺寸均为25mm。测试的膜包括亲水性PTFE、再生纤维素(RC)和聚丙烯(PP)。

结论

• 过滤器验证是各种药物QC测试的关键部分，在方法验证过程中需要考虑各种过滤器参数。由于这些QC测试需要准确定量分析物，因此分析物结合是过滤器验证期间需要考虑的重要因素。
• 膜和分析物的物理化学性质对分析物回收率的影响最大。分析物处于低浓度会加剧这种效应。
• 膜孔径对分析物回收率的影响有限，孔径的选择取决于下游分析技术。
• 对样品和标准品使用不同的处理技术会影响分析物回收率，因此标准品最好与样品使用相同的处理过程。
• 针头式过滤器的设计差异导致其在体积回收率上也存在差异。这对于小样本量和过滤器饱和度而言至关重要。