使用Titan C18柱进行水溶性维生素HPLC分析

简介

维生素是正常代谢所必需的重要化合物。它们天然存在于许多食品中，也经常被添加到加工食品中。水溶性维生素包括硫胺素（B1），核黄素（B₂），烟酸（B₃），吡哆醇（B₆），泛酸（₅），生物素（₇）等化合物。 ），叶酸（₉）和氰钴胺（B₁₂）。维生素的定性和定量分析是一项常规但具有挑战性的工作，因为维生素相对不稳定，并受到热、光、空气和其他食物成分等多种因素的影响。本报告利用Titan™C18 UHPLC 色谱柱来分析标准混合物和维生素水中的 B 族维生素。

实验

使用 Agilent 1290 UHPLC 系统进行离解。UV检测波长设定为 220 nm。本研究中使用的色谱柱为 Titan C18,5 cm x 2.1 mm I.D., 填充有单分散 1.9 μm 颗粒。柱温控制在 35℃，B 族维生素具有很强的亲水性，因此在反相条件下采用低浓度甲醇和酸性流动相的梯度进行洗脱。

水溶性维生素是从我们这里获得的。大多数 B 族维生素溶于水。将核黄素和生物素溶于 1m KOH 中，每天制备溶液。

橙味维生素水购于杂货店。将其通过 0.2 μm 针头式过滤器过滤，以用于样品制备。

结果和讨论

B 族维生素可用低浓度的乙腈或甲醇从反相柱中洗脱。在pH为3时，很少有化合物（硫胺素、吡哆醇、烟酰胺）能够在 C18 Titan 柱上少量保留下来，只需要 0.5% 的甲醇进行洗脱。生物素、氰钴胺素和核黄素维生素的疏水性更强，并且保留得更多。梯度洗脱要求甲醇浓度增加到 30%。Titan C18 柱对所有 9 种维生素均表现出良好的保留性，易于实现所有维生素峰值的基线分离（图 1）。所有维生素在 2.5 分钟内洗脱，峰形良好。Titan C18柱虽然含有亚 2 微米颗粒，但使用甲醇溶液流动相时总背压并不会过高；而据之前所知，其可压缩性较差，会导致背压高于使用乙腈溶液流动相。Titan 柱背压在分离过程中达到峰值 550 bar。粒径越小，分离速度越快。

该 HPLC法被应用于进行维生素水中 B 族维生素的分析。在注射到 HPLC 之前先将饮料过滤，不需要稀释。通过与标准混合物比较，确定了四种 B 族维生素的峰值（图 2）。

标准溶液为100 μg/mL，但泛酸钙、核黄素和生物素溶液为250 μg/mL。
条件：柱：Titan C18，5 cm x 2.1mm，1.9 µm（产品编号 577122-U)；流动相：[A] 20 mM磷酸钾，pH 3.0；[B] 甲醇；梯度：0.5%B 0.5 分钟，1.3 分钟 增加到 30%B，在30%B 保持 1 分钟，再平衡至0.5%B 0.8 分钟；流速：0.5 mL/分钟（背压不超过 550 bar）；检测器：UV，220 nm；注射：0.5 µL

条件：柱：Titan C18，5 cm x 2.1mm，1.9 µm（577122-U）;  流动相：[A] 20 mM磷酸钾，pH 3.0；[B] 甲醇；梯度：0.5%B 0.5 分钟，1.3 分钟 增加到 30%B，在30%B 保持 1 分钟，再平衡至0.5%B 0.8 分钟；流速：0.5 mL/分钟（背压不超过 550 bar）；检测器：UV，220 nm；注射：0.5 µL

结论

使用Titan C18 柱进行分析，在 2.5 分钟内获得了 9 种水溶性维生素混合物的极好分离度。当使用甲醇水溶液梯度和流动相的酸性 pH 时，C18 柱上极性化合物的保留是充分的。该方法被应用于进行维生素水分析并确定了添加到水中的 4 种 B 族维生素。