贴壁细胞系的传代培养

ECACC Laboratory Handbook 4th Edition

目标

贴壁细胞系将在体外生长，直到它们覆盖可用的表面积或培养基营养物耗尽为止。此时，细胞系应进行继代或传代培养，以防止培养物死亡。为了传代培养细胞，需要将它们悬浮。粘附程度随细胞系的不同而不同，但在大多数情况下，需要用蛋白酶（例如胰蛋白酶）使细胞从烧瓶上脱落。然而，这种方法可能不适用于某些细胞系，因为蛋白酶对它们有害，或者所使用的酶会去除感兴趣的胞膜标记物/受体。在这些情况下，应借助细胞刮刀以机械方法使细胞悬浮于少量培养基中。

产品列表

• 细胞培养基 — 预热到适当的温度（有关正确的培养基和温度，请参阅ECACC细胞系数据表。）
• 70％ (v/v) 乙醇无菌水溶液(793213)
• 不含Ca²⁺/Mg²⁺的PBS（D8537）
• 0.05%胰蛋白酶/EDTA的HBSS溶液，不含Ca²⁺/Mg²⁺（T3924）
• 大豆胰蛋白酶抑制剂（T6522）或FBS
• 台盼蓝溶液 (T8154)

设备

• 个人防护装备（无菌手套、实验室外套、护目镜）
• 设置到适当温度的水浴
• 适当密封水平的生物安全柜
• 培养箱
• 预先标记的培养瓶
• 倒置相差显微镜
• 离心机
• 血细胞计数器或类似Scepter™细胞计数仪的自动细胞计数仪
• 马克笔
• 移液管
• 安瓿瓶架
• 纸巾

操作流程

1. 使用倒置显微镜观察培养物，以评估汇合度，并确认不存在细菌和真菌污染物。
2. 除去用过的培养基。
3. 用不含Ca²⁺/Mg²⁺的PBS洗涤细胞单层。如果细胞粘附牢固，则重复该洗涤步骤。
4. 用移液器将胰蛋白酶/EDTA按照约1 mL/25 cm² 表面积加到洗过的单层细胞上。旋转烧瓶以使胰蛋白酶覆盖单层。倒出多余的胰蛋白酶。
5. 将烧瓶放回到培养箱，静置2-10分钟。
6. 使用倒置显微镜查看细胞，确保所有细胞都脱离并漂浮。可以轻拍烧瓶的侧面以使任何剩余的贴壁细胞脱落。
7. 将细胞重悬于少量新鲜的含血清培养基中，以灭活胰蛋白酶。取出100-200 μL并进行细胞计数。如果细胞是用无血清培养基培养的，则使用胰蛋白酶抑制剂，例如黄豆胰蛋白酶抑制剂灭活胰蛋白酶。
8. 将所需数量的细胞转移到含有预热培养基的带标签的新烧瓶中（有关所需的接种密度，请参阅ECACC细胞系数据表）。
9. 适当孵育细胞系。
10. 视细胞系生长特征的需要，重复该过程。

要点

1. 有些培养物虽然是作为贴壁细胞系生长的，但只是稍微附着在瓶壁，因此必须确保保留培养基，且在挪动烧瓶时必须多加小心，以防细胞过早脱落。
2. 尽管大多数细胞能够在仅有胰蛋白酶存在的情况下分离，但加入EDTA可以通过去除抑制性的阳离子增强酶的活性。
3. 胰蛋白酶在血清存在的条件下会失活。因此，必须用不含Ca²⁺/Mg²⁺的PBS洗涤单层细胞来将所有痕量血清从培养基中除去。
4. 细胞接触蛋白酶/EDTA的时间应仅够分离细胞。长时间接触可能会损害细胞表面受体。
5. 在将细胞接种到新瓶之前，应使用血清中和胰蛋白酶，否则细胞不会附着。
6. 还可以通过添加大豆胰蛋白酶抑制剂来中和胰蛋白酶，即向胰蛋白酶消化的细胞中加入等体积的浓度为1 mg/ml的抑制剂。如上所述，然后将细胞离心，重悬于新鲜培养基中并计数。这对于无血清细胞培养物尤其必要。
7. 如果没有CO₂培养箱，可用经0.2 μm滤器过滤的含有5％ CO₂和95%空气的气体向烧瓶充气1-2分钟。
8. 如果收获的细胞密度太低而不能以适当的细胞密度重新接种于新的烧瓶中，则可能需要离心细胞，例如5分钟、150 x g，然后重悬于较小体积的培养基中。

图 1. 贴壁细胞系举例。NIH 3T3细胞在冻融后24小时(A)和72小时(B)表现出了典型的贴壁成纤维细胞形态。应对汇合度进行密切监测并在达到~80%时进行传代