使用血细胞计数器进行细胞计数

目标

对于大多数需使用细胞系的操作，如转染、细胞融合技术、冷冻保存和传代培养等，有必要在操作前对细胞数进行定量。使用相同数量的细胞将保持最佳生长，并有助于使用细胞培养的程序标准化。这反过来也使结果具有更好的再现性。

产品列表

• 细胞培养基：预热到适当的温度（有关正确的培养基和温度，请参阅ECACC细胞系数据表。）
• 70％ (v/v) 乙醇无菌水溶液(793213)
• 台盼蓝溶液 (T8154)
• 0.05%胰蛋白酶/EDTA的HBSS溶液，不含Ca²⁺/Mg²⁺（T3924）

设备

• 个人防护装备（无菌手套、实验室外套、护目镜）
• 设置到适当温度的水浴
• 适当防护水平的生物安全柜
• 离心机
• CO₂培养器
• 血细胞计数板
• 倒置相差显微镜
• 预先标记的培养瓶

操作流程

1. 用上述胰蛋白酶/EDTA使贴壁和半贴壁细胞悬浮，并将其重悬于至少相当于胰蛋白酶体积的一定体积的新鲜培养基中。对于成团生长的细胞，离心后在小体积中重悬，轻轻移液以吸碎成团。
2. 在无菌条件下，移取100-200μL细胞悬液。
3. 加入等体积的台盼蓝（稀释倍数 =2），轻轻移液混匀。
4. 清洁血细胞计数器。
5. 用水或哈气湿润盖玻片。轻压盖玻片，使其在腔室内来回滑动，直到出现牛顿折射环（牛顿折射环在盖玻片下视为彩虹状环）。
6. 用细胞悬液（约 5-10μl）填充腔室两侧，用x20放大倍数在倒置相差显微镜下进行观察。
7. 计数活细胞（亮细胞）和非活细胞（染成蓝色）的数量。理想情况下应计数 >100 个细胞，以提高细胞计数的准确性（见下文注意事项）。请注意获得>100细胞计数的方格数。
8. 使用下面的公式计算活细胞和非活细胞的浓度以及活细胞的百分比。

要点

1.台盼蓝有毒，是潜在的致癌物。应穿戴防护服、手套和面部/眼睛护罩。请勿吸入蒸气。

2.计数室的中心面积为 1 mm²。该区域被细分为 25 个更小的方格 (1/25 mm²)。每一个方格都被三线包围，然后进一步分成 16小块 (1/400 mm²)。腔室深度 0.1 mm。

3.10⁴的修正因子将0.1 mm³转化到 1 mL (0.1 mm³ = 1 mm² x 0.1 mm)

4.有几个影响准确性的因素：

•  计数室中存在气泡和碎片
• 计数室过满，使样品流入通道或其他室
•  腔室填充不完全 细胞未均匀分布在整个腔室中
•  计数细胞太少。这可以通过离心细胞，在更小的体积重悬以及重新计数来
•  计数细胞太多。这可以通过使用更高稀释倍数的台盼蓝来解决，例如 1:10

5.血细胞计数器的使用可能较为耗时，易受操作者主观判断的影响，并且某些细胞类型，如形成簇的细胞类型，尤其难以用这种方法计数。现有的细胞计数设备可提供替代的细胞定量方法，包括Scepter™细胞计数器。Muse^® 细胞分析仪可实现基于流式细胞仪的细胞计数和活力评估。Scepter™细胞计数仪是一款便携式手持细胞计数仪，其使用库尔特原理对体积进行测定。它可以基于大小来量化细胞，并且可以将较大的细胞与较小的碎片区分开，这与基于视觉的技术不同，后者依赖于对象识别软件并且无法可靠地检测到较小的细胞。Scepter™细胞计数仪检测每个细胞，并将细胞大小分布以直方图的形式显示出来，将细胞划分为群。从直方图中，可对所有细胞计数，或者使用选通功能对选定的细胞子群加以计数。通过监测不同实验中直方图的变化，可以深入了解细胞培养的健康和质量。

图 1. 使用血细胞计数器和台盼蓝进行细胞计数。活细胞含有完整的细胞膜，不会摄取台盼蓝，在血细胞计数器中显得明亮/透明。死细胞具有破坏的细胞膜，并会吸收台盼蓝，在血细胞计数器中呈蓝色。细胞活力可以通过计算活细胞/死细胞的比例来进行估算。