肿瘤干细胞成球实验方案

• 简介
• 肿瘤成球实验方案
• 典型结果
• 提示和技巧

简介

实体瘤以三维(3D)空间构象生长，导致氧和营养物质以及其他物理和化学应力的异质性暴露。为了模拟三维空间构象，在肿瘤研究中普遍使用三 维体外培养模型。肿瘤干细胞 (CSC) 是指肿瘤内具有自我更新能力的那一小部分细胞，常常在化疗治疗后驱动肿瘤恶变和复发。传统上，肿瘤干细胞会从癌细胞系和肿瘤活检组织中分离出来，并在三维肿瘤球状体悬浮培养物中生长。

图 1. 肿瘤成球实验方案概述

肿瘤成球实验方案

1. 使用胰蛋白酶-EDTA 溶液 (T3924 ) 分离含有贴壁生长癌细胞系的肿瘤干细胞。细胞融合度应为80-90%，且状态良好。
2. 以300 x g离心细胞悬液 5分钟并吸出上清液。将细胞重悬于少量培养物中，例如 3-5 mL 的 3dGRO™ 球状体培养基 ( S3077 )。
3. 计数细胞 (PHCC20060)，并用 3dGRO™ 球状体培养基调节其体积，以使浓度达到1X10⁶个细胞/ml。
4. 将细胞以1X10⁴ 个细胞/ml 的浓度接种于适当的悬浮培养容器中，例如，在Corning^® Costar^® 超低吸附多孔板 ( CLS3471 ) 的每个孔中接种 4 mL共含40,000 个细胞的3dGRO™ 球状体培养基。
5. 根据使用的细胞类型，孵育培养物 4-10 天。每 3-4 天添加一半培养体积的新鲜 3dGRO™ 球状体培养基。不要像传统二维细胞培养一样一次性更换所有培养基。
   
6. 在肿瘤球状体培养基开始形成深色中央区之前将其传代。根据所使用的细胞类型，最佳传代应在 4-10 天后完成。
7. 用血清移液管将细胞和培养基转移到 15 mL 锥形管，采集肿瘤球状体。
8. 让肿瘤球状体在室温下重力沉降 10分钟。吸出上清液，但在锥形管中保留约 200μl。注意不要吸出肿瘤球状体。
9. 用等体积PBS (D8662) 重复步骤 7-8。轻轻吸出 PBS，在锥形管中留下约 200μl。
10. 向肿瘤球状体中加入 1 mL 胰蛋白酶-EDTA ( T3924 ) 溶液，室温反应 2–4分钟。每 30 秒上下移液一次，使肿瘤球状体重悬于胰蛋白酶溶液中。避免肿瘤球状体沉降。
    注意：用户必须根据经验确定完全解离每种细胞所需的最佳反应时间。虽然在大多数情况下 2-3分钟最佳，但某类细胞的肿瘤球状体，例如 MCF-7，可能需要更长的反应时间——特别是在传代多次以后。如果您青睐完全明确的解离过程，可根据供应商的说明使用重组胰蛋白酶 ( T3449 ) 溶液作为替代解离试剂。
11. 用 1000μl 移液管上下吹打肿瘤球状体 10-20 次，以生成单细胞悬液。正常吸出细胞悬液，但在排出细胞时，将吸管尖端在管底略微倾斜。产生的剪切力可促进所有残余细胞聚集体分解。进行肉眼检查，确认无大细胞聚集体残留。研磨后立即加入两倍体积的胰蛋白酶中和溶液 ( T6414 ) 或培养基。
    注意：不要过度研磨，以免影响细胞活力。通过 40 μm 细胞过滤器过滤细胞悬液，可以除去未解离的细胞聚集体。
12. 测定细胞数量和活力。以300 xg 离心细胞 5分钟。弃去上清液，将细胞以1X10⁶个细胞/ml的密度重悬于新鲜的 3dGRO™ 球状体培养基中。
13. 在全新的 Corning^® Costar^® 超低吸附多孔板 ( CLS3471 ) 上以 1X10⁴ 个细胞/ml 的密度重新接种细胞。通常情况下，6 孔板每孔加入 4 mL 共含4X10⁴个细胞的培养基 。

典型结果

图 1. 在 3dGRO™ 球状体培养基中培养的第 1 代 (A) 和第 5 代 (B) MCF7 乳腺癌细胞的肿瘤成球

图 2. 在 3dGRO™ 球状体培养基中培养的第 1 代 (A) 和第 5 代 (B) E006AA 前列腺癌细胞的肿瘤成球。

提示和技巧

一些细胞，例如 E3006AA 细胞，在前几次传代中表现出生长抑制或附着于三维培养板上，但后期将适应三维培养环境并在约第 3 次传代后再次增殖。