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阿尔茨海默病生物标记物多重和高灵敏度免疫测定

对于阿尔茨海默病等复杂神经退行性疾病，可结合多重和高灵敏度免疫测定技术检测其生物标志物，帮助研究人员更深入地了解疾病机制。本文介绍了如何结合MILLIPLEX®多重和SMC®高灵敏度免疫测定技术，检测人脑脊液、血浆和血清样本中阿尔茨海默病(AD)生物标志物。

 

AD研究为何要结合使用多重和高灵敏度免疫测定技术？

监测阿尔茨海默病(AD)患者的脑脊液（CSF）中的蛋白质生物标记物，对于了解疾病的进展极具价值1。多重免疫测定可让研究人员通过一次实验同时测定多种生物标志物，获得大量可靠数据。尽管几种CSF生物标记物能够可重现地区分正常和患病样品，但CSF是一种很难在研究中获得的生物液。

对基于血液的AD生物标志物的需求推动了对新型候选蛋白的不懈探索2。然而，血液来源生物标志物的发现可能受标准免疫测定灵敏度限制。高灵敏度免疫测定技术可检测各种生物液中的低丰度蛋白，为发现新型生物标记物创造了机会，彻底革新了神经退行性疾病研究3,4。


如何结合使用多重和高灵敏度免疫测定技术

为证明单分子计数(SMC®)技术对各种样本中的阿尔茨海默病生物标志物的超灵敏定量能力，使用来自AD患者和健康对照的CSF、血浆和血清（先）对MILLIPLEX®神经科学相关试剂盒进行评估。

人CSF、血浆和血清由商业供应商（Discovery Life Sciences、BioIVT和PrecisionMed）取自AD患者和无AD正常对照。按照试剂盒的实验方案要求，不稀释或稀释样品。通过非配对t检验(unpaired t-test)计算所有分析物的P双尾值(two-tail p-value)（GraphPad Prism软件）。

按照产品说明书要求，在96孔板中进行MILLIPLEX®多重测定。在Luminex® 200™系统上测定平均荧光强度(MFI)，并用MILLIPLEX® Analyst 5.1软件分析数据。

采用的多重测定试剂盒如下：

  • 采用MILLIPLEX®人β-淀粉样蛋白和Tau蛋白Panel（货号 HNABTMAG-68K）定量以下分析物：1:2稀释CSF样本中的β-淀粉样蛋白(1-40)(Aβ40)、β-淀粉样蛋白(1-42)(Aβ42)、总Tau蛋白(tTau)和pTau T181。
  • 采用MILLIPLEX®人神经科学Panel 1（货号 HNS1MAG-95K）定量以下分析物：CSF未稀释样本中的α-突触核蛋白、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、PARK5 (UCHL1)、PARK7 (DJ-1)和转谷氨酰胺酶2(TGM2)。
  • 采用MILLIPLEX®人神经科学Panel 2（货号 HNS2MAG-95K）定量以下分析物：1:10稀释CSF、血清和血浆样品中的血管生成素(ANG)、ApoE4、FABP3、铁蛋白、神经颗粒蛋白(NGRN)和TREM2。该panel已通过CSF和血液（血清和血浆）样品检测验证。

采用SMC®β-淀粉样蛋白1-40高灵敏度免疫测定剂盒（货号 03-0145-00）和SMC®-淀粉样蛋白1-42免疫测定试剂盒（货号 03-0146-00），根据产品说明书定量分析β-淀粉样多肽。分别采用ERENNA®和SMCxPRO®仪器两款仪器，定量分析SMC®免疫测定结果：。ERENNA®和SMCxPRO®平台分别采用Sgx Link™和xPRO®软件进行数据采集和分析。

 

多重测定结果

MILLIPLEX®多重免疫测定是公认的神经退行性疾病生物标志物测定重要工具。

CSF样品

先测定正常和AD患者CSF样品中的几种经典和新型神经退行性疾病生物标记物，再测定血清和血浆样品中的生物标记物。测定所用的各试剂盒的标准曲线如图1所示。

 

利用多重免疫测定技术进行神经科学研究。MILLIPLEX®(A)人β-淀粉样蛋白和Tau蛋白试剂盒、(B)人神经科学Panel 1和(C)人神经科学Panel 2的标准曲线的MFI值。

图 1.利用多重免疫测定技术进行神经科学研究。MILLIPLEX® (A)人β-淀粉样蛋白和Tau蛋白试剂盒、(B)人神经科学Panel 1和(C)人神经科学Panel 2的标准曲线。

采用多因子试剂盒检测AD患者和健康对照（正常）的CSF样品，测定两者在特定生物标记物上的浓度差异。每种试剂盒都反映了AD CSF样品相比对照样品的改变（图2）。

正常和AD CSF样品的MILLIPLEX® 多重生物标记物分析，包括pTau181、NSE、神经颗粒蛋白、Aβ42和GFAP。

图 2.正常和AD CSF样品的多重生物标记物分析。

采用MILLIPLEX®神经科学试剂盒测定人CSF中的16种蛋白。每种试剂盒都分析了正常和AD CSF两种样品，揭示两者的生物标志物差异：磷酸化Tau(p=0.0009)、Aβ42(p=0.0476)、NSE(p=0.008)、GFAP(p=0.0016)、UCHL1（p=0.0088，数据未显示）和神经颗粒蛋白(p=0.0359)。

每种试剂盒的样品量如下：

  • 人β-淀粉样蛋白和Tau蛋白Panel：正常CSF，n=14；AD CSF，n=16
  • 人神经科学Panel 1：正常CSF，n=15；AD CSF，n=8
  • 人神经科学Panel 2：正常CSF，n=7；AD CSF，n=7

在人β-淀粉样蛋白和Tau蛋白Panel检测中，AD CSF的Aβ42下降，磷酸化-Tau(Thr181)升高，这些经典AD生物标记物的分析结果与已有的结果一致5。根据人神经科学Panel 1的测定，AD CSF中的NSE和GFAP浓度均有上升。在人神经科学Panel 2的分析中，AD CSF的神经颗粒蛋白NRGN浓度高于对照。

 

血清和血浆样本

人神经科学Panel 2还可用于检验血清和血浆样本，于是我们接着检查了循环系统中的分析物是否具有蛋白表达差异。AD患者血浆和血清的FABP3均升高，AD血清的TREM2升高，AD血浆的NRGN升高（图3）。

 

正常和AD血浆和血清样品的MILLIPLEX®多重生物标记物测定，包括TREM2、FABP3和神经颗粒蛋白。

图 3.正常和AD血浆和血清样品的多重AD生物标记物测定。

使用MILLIPLEX®人神经科学Panel 2，测定AD患者血浆(n=5)和血清(n=6)与健康对照血浆(n=12)和血清(n=8)中的疾病相关蛋白。通过人神经科学Panel 2对血清和血浆的分析发现，AD样品相比健康对照，TREM2（血清p=0.0083）、FABP3（血清p=0.0204，血浆p=0.002）和神经颗粒蛋白（血浆p=0.0044）升高。

高灵敏度测定结果

尽管（通过上述多重测定结果发现）多种分析物具有成为基于血液的AD生物标志物潜力，但其他血液低丰度蛋白的分析必须依靠SMC®技术的高灵敏度测定平台。SMC®技术可测定人血浆样品中的β-淀粉样多肽（图4）。AD血浆Aβ40(p=0.028)略微升高。血浆Aβ42未见变化。重要的是，SMC® Aβ42试剂盒成功测定到CSF的Aβ42 (p=0.0116)下降，这属于AD的特征性表现。CSF的Aβ40(p=0.0055)水平也有变化。Aβ40和Aβ42试剂盒均相继在SMCxPRO®器、ERENNA®仪器上进行读数，显示SMC®的不同检测平台具有出色的相关性。

正常和AD血浆、血清、CSF样品生物标记物（Aβ42和Aβ40）的SMC®高灵敏度免疫测定结果中，不同检测仪器的相关性。

图 4.高灵敏度免疫测定正常和AD血浆、血清、CSF样品生物标记物时，不同检测仪器的相关性。

分别使用相应的SMC®高灵敏度免疫测定试剂盒，测定AD患者和正常对照CSF和血浆中的Aβ40和Aβ42水平。AD患者和健康对照的血浆(p=0.028)和CSF(p=0.0055)Aβ40均观测到差异。AD CSF(p=0.0116)中的Aβ42下降，血浆(p=0.9733)中未见变化。先后在SMCxPRO®仪器和ERENNA®仪器上分析测定CSF的同一反应板，结果证明这两种平台具有高度相关性，如图4所示。


每种试剂盒的样品量如下：

  • SMC®β-淀粉样蛋白1-40高灵敏度免疫测定试剂盒：正常CSF(n=20)，AD CSF(n=10)，正常血浆(n=10)，AD血浆(n=10)
  • SMC®β-淀粉样蛋白1-42高灵敏度免疫测定试剂盒：正常CSF(n=8)，AD CSF(n=8)；正常血浆(n=10)，AD血浆(n=10)

总金额

采用MILLIPLEX®和SMC®免疫分析技术，测定了CSF、血浆和血清样品中的多种神经退行性疾病相关蛋白。在CSF中，Aβ42和磷酸化Tau蛋白等经典AD生物标志物的变化符合预期模式。此外，AD CSF中的神经颗粒蛋白和GFAP等蛋白浓度升高。分析血浆和血清样品中的潜在血液来源AD生物标记物，发现几种富有前景的候选蛋白。这些结论仍需大规模的队列研究来证实。

采用专用方法，结合多种技术平台和免疫分析方法，分析了CSF、血浆和血清样品中的AD生物标记物。上述MILLIPLEX®和SMC®免疫测定产品提供的可靠资源，可帮助我们研究各种生物液中广泛的神经退行性疾病生物标记物。

 

材料表
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仅供研究使用，不可用于诊断。

相关网络研讨会

观看以下研讨会，了解关于本研究的报告。

多重免疫测定检测脑脊液、血浆和血清中的阿尔茨海默病生物标记物

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参考文献

1.
Lleó A, Cavedo E, Parnetti L, Vanderstichele H, Herukka SK, Andreasen N, Ghidoni R, Lewczuk P, Jeromin A, Winblad B, et al. 2015. Cerebrospinal fluid biomarkers in trials for Alzheimer and Parkinson diseases. Nat Rev Neurol. 11(1):41-55. https://doi.org/10.1038/nrneurol.2014.232
2.
Hye A, Riddoch?Contreras J, Baird AL, Ashton NJ, Bazenet C, Leung R, Westman E, Simmons A, Dobson R, Sattlecker M, et al. 2014. Plasma proteins predict conversion to dementia from prodromal disease. Alzheimer's & Dementia. 10(6):799. https://doi.org/10.1016/j.jalz.2014.05.1749
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Hwang J, Banerjee M, Venable AS, Walden Z, Jolly J, Zimmerman C, Adkisson E, Xiao Q. 2019. Quantitation of low abundant soluble biomarkers using high sensitivity Single Molecule Counting technology. Methods. 15869-76. https://doi.org/10.1016/j.ymeth.2018.10.018
4.
Blennow K, Zetterberg H. 2015. Understanding Biomarkers of Neurodegeneration: Ultrasensitive detection techniques pave the way for mechanistic understanding. Nat Med. 21(3):217-219. https://doi.org/10.1038/nm.3810
5.
Olsson B, Lautner R, Andreasson U, Öhrfelt A, Portelius E, Bjerke M, Hölttä M, Rosén C, Olsson C, Strobel G, et al. 2016. CSF and blood biomarkers for the diagnosis of Alzheimer's disease: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Neurology. 15(7):673-684. https://doi.org/10.1016/s1474-4422(16)00070-3
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