KK5121

Mélange KAPA2G de génotypage rapide

suitable for PCR, 2 ×

• Synonyme(s) : PCR, génotypage
• Code UNSPSC : 41106300
• Nomenclature NACRES : NA.54

Propriétés

• Utilisation: sufficient for 500 reactions; 25 μL sufficient for 500 reactions
• Niveau de qualité: 100
• Durée de conservation: ≤18 mo.
• Caractéristiques: dNTPs included; hotstart: no
• Fabricant/nom de marque: Roche
• Concentration: 2 ×
• Technique(s): PCR: suitable; genotyping: suitable
• Entrée: crude DNA
• Température de stockage: −20°C

Description

Description générale

Le mélange de génotypage rapide KAPA2G (2X) prêt à l′emploi contient tous les constituants nécessaires pour réaliser la réaction d′amplification en chaîne par polymérase (PCR) rapide, à l′exception des amorces et des matrices. Le ReadyMix^™ contient également deux colorants inertes, permettant l′analyse des produits de réaction de PCR par électrophorèse sur gel d′agarose sans devoir ajouter un tampon de charge de l′ADN. Le système KAPA Express Extract contient une protéase thermostable, conçu pour accélérer la lyse de l′échantillon. KAPA Express Extract, un nouveau système de protéase thermostable et de tampon permettant d′extraire de l′ADN prêt pour la PCR à partir d′un tissu de souris en seulement 15 minutes, et le mélange de génotypage rapide avec colorant KAPA2G, contenant une ADN polymérase modifiée par évolution dirigée pour lui conférer une grande capacité de traitement et une vitesse d′action ultra-rapide. L′association de KAPA Express Extract et du mélange de génotypage rapide KAPA2G permet d′extraire et d′amplifier de manière fiable des fragments d′ADN à partir de tissus de souris en seulement 1 heure, comparativement à ≥1 jour pour les protocoles classiques.

Application

Le mélange KAPA2G de génotypage rapide :

• a été utilisé pour l′extraction et l′amplification d′ADN à partir de tissus de queue, d′oreille ou d′orteil de souris
• a été utilisé pour l′extraction et l′amplification d′ADN à partir d′autres tissus d′origine animale et d′hybridomes
• peut être utilisé dans l′amplification en chaîne par polymérase (PCR).

Actions biochimiques/physiologiques

L′ADN extrait avec le système KAPA Express Extract est amplifié à l′aide du mélange de génotypage rapide avec colorant KAPA2G. Les fragments d′ADN obtenus avec le mélange de génotypage rapide KAPA2G comportent une queue 3′-dA et peuvent être insérés dans les vecteurs de clonage TA ou utilisés pour les analyses ou applications en aval de routine, y compris la digestion par enzymes de restriction, le clonage et le séquençage. Comme la Taq de type sauvage, l′enzyme KAPA2G rapide possède des activités de polymérase 5′→3′ et d′exonucléase 5′→3′, mais aucune activité d′exonucléase 3′→5′ correctrice (relecture). La fidélité de Kapa2G rapide est comparable à celle de la Taq de type sauvage ; son taux d′erreur est d′environ 1 erreur par 1,7 x 10⁵ nucléotides incorporés. La lyse est effectuée dans un thermocycleur, bloc chauffant ou bain-marie, puis l′échantillon est centrifugé pour récupérer le surnageant contenant l′ADN. Le surnageant est ensuite dilué d′un facteur 10 avant d′être utilisé comme matrice pour la PCR. Contrairement aux protocoles existants qui utilisent une étape de digestion par la protéinase K, les extractions réalisées à l′aide de KAPA Express Extract sont effectuées dans un seul tube pour plus de commodité et ne nécessitent ni produit chimique dangereux, ni plusieurs étapes de lavage. Cela réduit largement le risque de perte d′échantillon ou de contamination. Le procédé produit une quantité de matrice suffisante pour plusieurs analyses et est facilement adaptable à la manipulation d′échantillons sur des plaques à 96 puits. Chaque extraction produit suffisamment de matrice pour réaliser au moins 100 réactions de génotypage par PCR. Les extraits (dilués ou non) sont stables pendant au moins 6 mois à une température de -15 à -25 °C.

Caractéristiques et avantages

Augmentation de la cadence d′analyse, diminution du délai d′exécution et amélioration de la fiabilité :

• Production d′ADN prêt pour la PCR en seulement 15 minutes.
• Manipulations minimales, réduisant le risque de perte d′échantillon ou de contamination.
• Quantité de matrice suffisante pour plusieurs analyses, facilement adaptable à la manipulation d′échantillons sur des plaques de 96 puits.
• Amplification fiable et rapide de fragments d′ADN pour une large gamme de longueurs d′amplicon et de taux de GC.

Dépassement des performances des méthodes d′extraction brute et des kits du commerce :

• Réduction des temps d′exécution
• Augmentation de la spécificité
• Réduction des coûts

Remarques :

• Extraction d′ADN prêt pour la PCR à partir de tissus de queue, d′oreille ou d′orteil de souris en 15 minutes. Avant de procéder à la PCR, diluer dix fois l′extrait d′ADN dans du tampon Tris-HCl 10 mM (pH 8,0–8,5), puis utiliser 1 μl d′ADN par réaction de 25 μl.
• Les extraits sont stables 6 mois à -20 °C.
• Le mélange de génotypage rapide (à démarrage à chaud) KAPA2G contient l′ADN polymérase rapide KAPA2G modifiée pour PCR rapide, ainsi qu′un tampon, du MgCl₂ (1,5 mM en 1X) et des dNTP (0,2 mM chacun en 1X).
• Le mélange de génotypage rapide KAPA2G comprend un tampon de charge pour électrophorèse contenant un colorant, ce qui permet de placer directement les produits de PCR sur des gels d′agarose pour l′analyse.
• Utiliser un temps d′hybridation de 15 s, en rajoutant 15 s pour les amplicons <1 kb, ou 15–30 secondes de plus par kilobase pour les amplicons plus longs.

Qualité

Tous les constituants des kits de génotypage de souris KAPA sont soumis à des tests de contrôle qualité exigeants, ne présentent aucune activité endonucléase/exonucléase contaminante et répondent à des critères stricts en matière de contamination par l′ADN.

Notes préparatoires

Assurez-vous toujours que le produit soit complètement décongelé et mélangé avant emploi. Les réactifs peuvent être stockés à 4 °C pour une utilisation à court terme (jusqu′à 1 mois). Pour un stockage à long terme, replacez-les à-20 °C. Si tous les constituants ont été manipulés avec les soins nécessaires et ne sont pas contaminés, le kit ne devrait pas être affecté s′il est laissé accidentellement à température ambiante pendant une courte durée (3 jours maximum).

Autres remarques

Pour une utilisation en recherche uniquement. Ne pas utiliser dans des procédures de diagnostic.

Informations légales

ReadyMix is a trademark of Sigma-Aldrich Co. LLC

Composants de kit seuls

• KAPA2G Fast DNA Polymerase
• KAPA2G Buffer A
• dNTPs 0.2 mM each at 1X
• MgCl₂ 1.5 mM at 1X
• stabilizers
• dye

Informations sur la sécurité

• Pictogrammes: GHS08
• Mention d'avertissement: Warning
• Mentions de danger: H371
• Conseils de prudence: P260 - P264 - P270 - P308 + P311 - P405 - P501
• Classification des risques: STOT SE 2
• Code de la classe de stockage: 12 - Non Combustible Liquids
• Classe de danger pour l'eau (WGK): WGK 1
• Point d'éclair (°F): does not flash
• Point d'éclair (°C): does not flash