17-10206
Biocapteur lentiviral LentiBrite GFP-tubuline
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About This Item
Code UNSPSC :
12352207
eCl@ss :
34360190
Nomenclature NACRES :
NA.32
Produits recommandés
Description générale
Lisez note d'application dans Nature Methods !
http://www.nature.com/app_notes/nmeth/2012/121007/pdf/an8620.pdf
(cliquez ici !)
Découvrez les avantages de nos biocapteurs lentiviraux LentiBrite ! Cliquez ici
Les biocapteurs peuvent être utilisés pour détecter la présence ou l'absence d'une protéine donnée, ainsi que la localisation subcellulaire de cette protéine dans une cellule vivante. Les marqueurs fluorescents sont souvent utiles pour visualiser la protéine d'intérêt au sein d'une cellule, soit par microscopie à fluorescence, soit par capture vidéo en accéléré. Visualiser les cellules vivantes sans les perturber permet aux chercheurs d'observer les conditions cellulaires en temps réel.
Les systèmes du type vecteur lentiviral constituent un outil de recherche populaire qui permet d'introduire des produits génétiques dans les cellules. La transfection lentivirale présente certains avantages par rapport aux méthodes non virales telles que la transfection par voie chimique, notamment une plus grande efficacité de transfection vis-à-vis des cellules en division ou non, une expression stable du transgène sur le long terme, et une faible immunogénicité.
EMD Millipore présente les biocapteurs lentiviraux LentiBrite, une nouvelle gamme de particules lentivirales pré-conditionnées codant pour des protéines importantes et fondamentales de l'autophagie, de l'apoptose et de la structure cellulaire, pour la visualisation de cellules vivantes dans différents états cellulaires/pathologiques et l'analyse in vitro.
Les particules lentivirales LentiBrite GFP-tubuline-α de EMD Millipore procurent une fluorescence intense et une localisation précise pour permettre l'analyse de la dynamique des microtubules dans les cellules vivantes difficiles à transfecter.
http://www.nature.com/app_notes/nmeth/2012/121007/pdf/an8620.pdf
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Les biocapteurs peuvent être utilisés pour détecter la présence ou l'absence d'une protéine donnée, ainsi que la localisation subcellulaire de cette protéine dans une cellule vivante. Les marqueurs fluorescents sont souvent utiles pour visualiser la protéine d'intérêt au sein d'une cellule, soit par microscopie à fluorescence, soit par capture vidéo en accéléré. Visualiser les cellules vivantes sans les perturber permet aux chercheurs d'observer les conditions cellulaires en temps réel.
Les systèmes du type vecteur lentiviral constituent un outil de recherche populaire qui permet d'introduire des produits génétiques dans les cellules. La transfection lentivirale présente certains avantages par rapport aux méthodes non virales telles que la transfection par voie chimique, notamment une plus grande efficacité de transfection vis-à-vis des cellules en division ou non, une expression stable du transgène sur le long terme, et une faible immunogénicité.
EMD Millipore présente les biocapteurs lentiviraux LentiBrite, une nouvelle gamme de particules lentivirales pré-conditionnées codant pour des protéines importantes et fondamentales de l'autophagie, de l'apoptose et de la structure cellulaire, pour la visualisation de cellules vivantes dans différents états cellulaires/pathologiques et l'analyse in vitro.
- Pré-conditionnés, marqués par fluorescence avec de la GFP et de la RFP
- Transfection plus efficace que les méthodes traditionnelles de transfection par voie chimique et autres techniques non virales
- Possibilité de transfecter les cellules en division, non en division, et les types de cellules difficiles à transfecter tels que les cellules primaires ou les cellules souches
- Ne perturbent pas les fonctions cellulaires
Les particules lentivirales LentiBrite GFP-tubuline-α de EMD Millipore procurent une fluorescence intense et une localisation précise pour permettre l'analyse de la dynamique des microtubules dans les cellules vivantes difficiles à transfecter.
Les microtubules sont des filaments cytosquelettiques dynamiques composés de sous-unités de tubuline qui jouent un rôle central durant la mitose (dans le fuseau mitotique) et durant l'interphase, en formant une structure permettant le déplacement directionnel des éléments cellulaires médié par la kinésine et la dynéine. Plusieurs familles d'agents se liant aux microtubules, comme les taxanes et les vinca-alcaloïdes (alcaloïdes de la pervenche), perturbent la dynamique des microtubules et provoquent la mort cellulaire. Ils constituent des agents chimiothérapeutiques efficaces sur le plan clinique. L'imagerie de la dynamique des microtubules dans des cellules vivantes exprimant de la tubuline marquée avec des protéines fluorescentes a grandement contribué à mieux comprendre les agents se liant aux microtubules.
Les particules lentivirales LentiBrite GFP-tubuline-α d'EMD Millipore procurent une fluorescence intense et une localisation précise, pour permettre l'analyse de la dynamique des microtubules dans les cellules vivantes difficiles à transfecter.
Les particules lentivirales LentiBrite GFP-tubuline-α d'EMD Millipore procurent une fluorescence intense et une localisation précise, pour permettre l'analyse de la dynamique des microtubules dans les cellules vivantes difficiles à transfecter.
Application
Imagerie par microscopie à fluorescence :
Des cellules HT-1080 ont été déposées sur une lame à chambre de culture puis ont été soumises à une transduction avec des particules lentivirales à une valeur de MOI de 20 pendant 24 heures. Après remplacement du milieu et 48 heures d'incubation supplémentaires, les cellules ont été fixées au formaldéhyde puis montées. Une image a été obtenue par microscopie en fluorescence à champ large en immersion dans de l'huile. La GFP-tubuline présente un signal fibrillaire, principalement cytoplasmique. Il est possible de visualiser les cellules mitotiques et la formation des fuseaux mitotiques.
Comparaison par immunocytochimie et analyse de modulateur :
(Voir la Figure 2 de la fiche technique)
Tout comme pour la Figure 1, des cellules HT-1080 ont été déposées sur une lame à chambre de culture puis ont été soumises à une transduction avec des particules lentivirales à une valeur de MOI de 20 pendant 24 heures. Après remplacement du milieu et 48 heures d'incubation supplémentaires, les cellules ont été laissées sans traitement, incubées pendant 4 heures avec du paclitaxel 1 µM (PTX, un stabilisant des microtubules), ou incubées pendant 4 heures avec du nocodazole 25 µM (NZL, un agent de dépolymérisation des microtubules). Les cellules traitées au PTX se sont arrondies et ont formé des "amas" de tubuline, alors que celles traitées au NZL ont supprimé leur structure de tubuline fibrillaire. Un marquage immunocytochimique (en rouge) des mêmes vues avec un anticorps monoclonal dirigé contre la tubuline-α a donné des profils d'expression similaires à celui de la GFP-protéine (en vert).
Types de cellules difficiles à transfecter :
(voir la Figure 3 de la fiche technique)
Des cellules primaires du type HUVEC ou HuMSC ont été déposées sur une lame à chambre de culture puis ont été soumises à une transduction avec des particules lentivirales à une valeur de MOI de 40 pendant 24 heures. Les cellules ont été laissées sans traitement, ou bien traitées pendant 4 heures avec du paclitaxel, un stabilisant des microtubules, à une concentration 1 µM.
Pour une visualisation optimale en fluorescence et une analyse optimale des cellules vivantes, il est recommandé d'évaluer le niveau d'expression cible dans les 24 à 48 heures suivant la transfection/infection, car l'intensité de fluorescence peut faiblir avec le temps, en particulier dans les lignées cellulaires difficiles à transfecter. Les cellules infectées peuvent être congelées après une transfection/infection réussie, puis décongelées et mises en culture de façon à conserver leur expression fluorescente positive au-delà de 24-48 heures. La durée et l'intensité de l'expression fluorescente varient d'une lignée cellulaire à l'autre. Des MOI supérieures peuvent être nécessaires pour les lignées cellulaires difficiles à transfecter.
Des cellules HT-1080 ont été déposées sur une lame à chambre de culture puis ont été soumises à une transduction avec des particules lentivirales à une valeur de MOI de 20 pendant 24 heures. Après remplacement du milieu et 48 heures d'incubation supplémentaires, les cellules ont été fixées au formaldéhyde puis montées. Une image a été obtenue par microscopie en fluorescence à champ large en immersion dans de l'huile. La GFP-tubuline présente un signal fibrillaire, principalement cytoplasmique. Il est possible de visualiser les cellules mitotiques et la formation des fuseaux mitotiques.
Comparaison par immunocytochimie et analyse de modulateur :
(Voir la Figure 2 de la fiche technique)
Tout comme pour la Figure 1, des cellules HT-1080 ont été déposées sur une lame à chambre de culture puis ont été soumises à une transduction avec des particules lentivirales à une valeur de MOI de 20 pendant 24 heures. Après remplacement du milieu et 48 heures d'incubation supplémentaires, les cellules ont été laissées sans traitement, incubées pendant 4 heures avec du paclitaxel 1 µM (PTX, un stabilisant des microtubules), ou incubées pendant 4 heures avec du nocodazole 25 µM (NZL, un agent de dépolymérisation des microtubules). Les cellules traitées au PTX se sont arrondies et ont formé des "amas" de tubuline, alors que celles traitées au NZL ont supprimé leur structure de tubuline fibrillaire. Un marquage immunocytochimique (en rouge) des mêmes vues avec un anticorps monoclonal dirigé contre la tubuline-α a donné des profils d'expression similaires à celui de la GFP-protéine (en vert).
Types de cellules difficiles à transfecter :
(voir la Figure 3 de la fiche technique)
Des cellules primaires du type HUVEC ou HuMSC ont été déposées sur une lame à chambre de culture puis ont été soumises à une transduction avec des particules lentivirales à une valeur de MOI de 40 pendant 24 heures. Les cellules ont été laissées sans traitement, ou bien traitées pendant 4 heures avec du paclitaxel, un stabilisant des microtubules, à une concentration 1 µM.
Pour une visualisation optimale en fluorescence et une analyse optimale des cellules vivantes, il est recommandé d'évaluer le niveau d'expression cible dans les 24 à 48 heures suivant la transfection/infection, car l'intensité de fluorescence peut faiblir avec le temps, en particulier dans les lignées cellulaires difficiles à transfecter. Les cellules infectées peuvent être congelées après une transfection/infection réussie, puis décongelées et mises en culture de façon à conserver leur expression fluorescente positive au-delà de 24-48 heures. La durée et l'intensité de l'expression fluorescente varient d'une lignée cellulaire à l'autre. Des MOI supérieures peuvent être nécessaires pour les lignées cellulaires difficiles à transfecter.
Domaine de recherche
Structure cellulaire
Structure cellulaire
Sous-domaine de recherche
Cytosquelette
Cytosquelette
Composants
Lentivirus avec TagGFP2-tubuline :
Un flacon contenant 25 µl de particules lentivirales correspondant à au moins 3 x 10E8 unités infectieuses (UI) par ml.
Pour connaître le titre spécifique d'un lot, consulter le “Titre viral” figurant dans les caractéristiques du produit sur la fiche technique.
Promoteur
EF-1 (facteur d'élongation 1)
Multiplicité d'infection (MOI)
MOI = rapport entre le nombre de particules lentivirales infectieuses (UI) et le nombre de cellules infectées.
Les valeurs de MOI permettant d'obtenir une grande efficacité de transduction et un signal de forte intensité se situent généralement dans la plage de 20 à 40. Pour cette cible, certains types de cellule peuvent nécessiter une valeur de MOI plus faible (par exemple, les cellules HT-1080 et les cellules endothéliales de veine ombilicale humaine (HUVEC)), tandis que d'autres peuvent nécessiter une valeur de MOI plus élevée (par exemple, les cellules HeLa, U2OS, ou les cellules souches mésenchymateuses (HuMSC)).
REMARQUE : La MOI doit être quantifiée et optimisée par l'utilisateur final pour chaque type de cellule et chaque cible lentivirale, afin d'atteindre l'efficacité de transduction et l'intensité de signal souhaitées.
Un flacon contenant 25 µl de particules lentivirales correspondant à au moins 3 x 10E8 unités infectieuses (UI) par ml.
Pour connaître le titre spécifique d'un lot, consulter le “Titre viral” figurant dans les caractéristiques du produit sur la fiche technique.
Promoteur
EF-1 (facteur d'élongation 1)
Multiplicité d'infection (MOI)
MOI = rapport entre le nombre de particules lentivirales infectieuses (UI) et le nombre de cellules infectées.
Les valeurs de MOI permettant d'obtenir une grande efficacité de transduction et un signal de forte intensité se situent généralement dans la plage de 20 à 40. Pour cette cible, certains types de cellule peuvent nécessiter une valeur de MOI plus faible (par exemple, les cellules HT-1080 et les cellules endothéliales de veine ombilicale humaine (HUVEC)), tandis que d'autres peuvent nécessiter une valeur de MOI plus élevée (par exemple, les cellules HeLa, U2OS, ou les cellules souches mésenchymateuses (HuMSC)).
REMARQUE : La MOI doit être quantifiée et optimisée par l'utilisateur final pour chaque type de cellule et chaque cible lentivirale, afin d'atteindre l'efficacité de transduction et l'intensité de signal souhaitées.
Qualité
Évaluée par transduction de cellules HT-1080 et imagerie en fluorescence afin d'estimer l'efficacité de transduction.
Forme physique
Précipitation au PEG
Stockage et stabilité
Manipulation et stockage
Stocké à -80 °C, le lentivirus est stable pendant au moins 4 mois à partir de la date de réception. Après la première décongélation, placer immédiatement sur de la glace et congeler sous forme d'aliquotes de travail à -80 °C. Les aliquotes congelées peuvent être conservées au moins 2 mois. D'autres congélations/décongélations peuvent entraîner une baisse du titre viral et de l'efficacité de transduction.
REMARQUE IMPORTANTE CONCERNANT LA SÉCURITÉ
Les vecteurs lentiviraux à réplication défaillante, tels que le vecteur de 3e génération fourni dans ce produit, ne sont pas connus pour causer des maladies, que ce soit chez l'homme ou chez l'animal. Cependant, les lentivirus peuvent s'intégrer dans le génome de la cellule hôte, et ainsi présenter un certain risque de mutagenèse par insertion. Ce produit fait partie du groupe de risque de niveau 2 et doit être manipulé dans un laboratoire de niveau de sécurité biologique 2 (LSB2). Une discussion détaillée sur la biosécurité des vecteurs lentiviraux est disponible dans la référence bibliographique suivante : Pauwels, K. et al. (2009). State-of-the-art lentiviral vectors for research use: Risk assessment and biosafety recommendations. Curr. Gene Ther. 9: 459-474.
Stocké à -80 °C, le lentivirus est stable pendant au moins 4 mois à partir de la date de réception. Après la première décongélation, placer immédiatement sur de la glace et congeler sous forme d'aliquotes de travail à -80 °C. Les aliquotes congelées peuvent être conservées au moins 2 mois. D'autres congélations/décongélations peuvent entraîner une baisse du titre viral et de l'efficacité de transduction.
REMARQUE IMPORTANTE CONCERNANT LA SÉCURITÉ
Les vecteurs lentiviraux à réplication défaillante, tels que le vecteur de 3e génération fourni dans ce produit, ne sont pas connus pour causer des maladies, que ce soit chez l'homme ou chez l'animal. Cependant, les lentivirus peuvent s'intégrer dans le génome de la cellule hôte, et ainsi présenter un certain risque de mutagenèse par insertion. Ce produit fait partie du groupe de risque de niveau 2 et doit être manipulé dans un laboratoire de niveau de sécurité biologique 2 (LSB2). Une discussion détaillée sur la biosécurité des vecteurs lentiviraux est disponible dans la référence bibliographique suivante : Pauwels, K. et al. (2009). State-of-the-art lentiviral vectors for research use: Risk assessment and biosafety recommendations. Curr. Gene Ther. 9: 459-474.
Informations légales
CHEMICON is a registered trademark of Merck KGaA, Darmstadt, Germany
Code de la classe de stockage
10 - Combustible liquids
Classe de danger pour l'eau (WGK)
WGK 2
Certificats d'analyse (COA)
Recherchez un Certificats d'analyse (COA) en saisissant le numéro de lot du produit. Les numéros de lot figurent sur l'étiquette du produit après les mots "Lot" ou "Batch".
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