17-10193
Biocapteur lentiviral LentiBrite GFP-LC3
Synonyme(s) :
Microtubule-associated proteins 1A/1B light chain 3, Autophagy-related protein LC3, Autophagy-related ubiquitin-like modifier LC3, MAP1A/MAP1B light chain 3, Microtubule-associated protein 1 light chain 3
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About This Item
Code UNSPSC :
12352207
eCl@ss :
34360190
Nomenclature NACRES :
NA.51
Produits recommandés
Description générale
Regardez une vidéo en accéléré de cellules vivantes subissant l'autophagie en utilisant le biocapteur lentiviral LentiBrite GFP-LC3 ! Cliquez ici
Lisez notre note d'application dans Nature Methods !
http://www.nature.com/app_notes/nmeth/2012/121007/pdf/an8620.pdf
(Cliquez ici !)
En savoir plus sur les avantages de nos biocapteurs lentiviraux LentiBrite ! Cliquez ici
Les biocapteurs peuvent être utilisés pour détecter la présence ou l'absence d'une protéine donnée, ainsi que la localisation subcellulaire de cette protéine dans une cellule vivante. Les marqueurs fluorescents sont souvent utiles pour visualiser la protéine d'intérêt dans une cellule par microscopie de fluorescence ou par capture vidéo par intervalles (time-lapse). Visualiser les cellules vivantes sans les perturber permet aux chercheurs d'observer les conditions cellulaires en temps réel.
Les systèmes à vecteur lentiviral constituent un outil de recherche prisé qui permet d'introduire des produits génétiques dans les cellules. La transfection lentivirale présente certains avantages par rapport aux méthodes non virales telles que la transfection par voie chimique, notamment une plus grande efficacité de transfection des cellules en division ou non, une expression stable du transgène sur le long terme et une faible immunogénicité.
EMD Millipore présente les biocapteurs lentiviraux LentiBrite, une nouvelle gamme de particules lentivirales pré-emballées codant pour des protéines importantes et fondamentales de l'autophagie, de l'apoptose et de la structure cellulaire, pour une visualisation sous différents états cellulaires/pathologiques dans des cellules vivantes et en analyses in vitro.
Les particules lentivirales LentiBrite GFP-LC3 de EMD Millipore apportent une fluorescence intense et une localisation précise pour permettre l'analyse de l'autophagie sur des cellules vivantes dans des types cellulaires difficiles à transfecter.
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Les biocapteurs peuvent être utilisés pour détecter la présence ou l'absence d'une protéine donnée, ainsi que la localisation subcellulaire de cette protéine dans une cellule vivante. Les marqueurs fluorescents sont souvent utiles pour visualiser la protéine d'intérêt dans une cellule par microscopie de fluorescence ou par capture vidéo par intervalles (time-lapse). Visualiser les cellules vivantes sans les perturber permet aux chercheurs d'observer les conditions cellulaires en temps réel.
Les systèmes à vecteur lentiviral constituent un outil de recherche prisé qui permet d'introduire des produits génétiques dans les cellules. La transfection lentivirale présente certains avantages par rapport aux méthodes non virales telles que la transfection par voie chimique, notamment une plus grande efficacité de transfection des cellules en division ou non, une expression stable du transgène sur le long terme et une faible immunogénicité.
EMD Millipore présente les biocapteurs lentiviraux LentiBrite, une nouvelle gamme de particules lentivirales pré-emballées codant pour des protéines importantes et fondamentales de l'autophagie, de l'apoptose et de la structure cellulaire, pour une visualisation sous différents états cellulaires/pathologiques dans des cellules vivantes et en analyses in vitro.
- Pré-emballés, marqués par fluorescence avec la GFP et la RFP
- Transfection à plus haute efficacité par rapport aux méthodes traditionnelles de transfection chimique et autres méthodes non virales
- Possibilité de transfecter des cellules en division ou non, et des types cellulaires difficiles à transfecter, tels que les cellules primaires ou les cellules souches
- Ne perturbe pas les fonctions cellulaires
Les particules lentivirales LentiBrite GFP-LC3 de EMD Millipore apportent une fluorescence intense et une localisation précise pour permettre l'analyse de l'autophagie sur des cellules vivantes dans des types cellulaires difficiles à transfecter.
Également disponible : le biocapteur lentiviral LentiBrite GFP-p62 ! Cliquez ici
Également disponible : le biocapteur lentiviral LentiBrite RFP-p62 ! Cliquez ici
L'autophagie, une voie de dégradation qui fournit aux cellules des nutriments recyclés en cas de stress, joue un rôle à la fois protecteur et délétère dans de nombreuses maladies, y compris le cancer, la neurodégénérescence et les infections. Les membres de la famille LC3 jouent un rôle clé dans la maturation de l'autophagosome, l'organite central de l'autophagie. Les précurseurs de LC3, distribués de façon diffuse dans le cytosol, sont traités par protéolyse pour former le LC3-I. Lors de l'initiation de l'autophagie, la glycine C-terminale est modifiée par l'ajout d'une phosphatidyléthanolamine pour former LC3-II, qui subit rapidement une translocation vers des autophagosomes naissants selon une distribution ponctuée. Des ADN de synthèse codant pour des protéines fluorescentes fusionnées à LC3 sont largement utilisés pour introduire celles-ci dans les cellules afin de suivre la formation des autophagosomes par microscopie de fluorescence.
Les particules lentivirales LentiBrite GFP-LC3 d'EMD Millipore apportent une fluorescence intense et une localisation précise pour permettre l'analyse de l'autophagie sur cellules vivantes dans les types cellulaires difficiles à transfecter.
Également disponible : le biocapteur lentiviral LentiBrite RFP-p62 ! Cliquez ici
L'autophagie, une voie de dégradation qui fournit aux cellules des nutriments recyclés en cas de stress, joue un rôle à la fois protecteur et délétère dans de nombreuses maladies, y compris le cancer, la neurodégénérescence et les infections. Les membres de la famille LC3 jouent un rôle clé dans la maturation de l'autophagosome, l'organite central de l'autophagie. Les précurseurs de LC3, distribués de façon diffuse dans le cytosol, sont traités par protéolyse pour former le LC3-I. Lors de l'initiation de l'autophagie, la glycine C-terminale est modifiée par l'ajout d'une phosphatidyléthanolamine pour former LC3-II, qui subit rapidement une translocation vers des autophagosomes naissants selon une distribution ponctuée. Des ADN de synthèse codant pour des protéines fluorescentes fusionnées à LC3 sont largement utilisés pour introduire celles-ci dans les cellules afin de suivre la formation des autophagosomes par microscopie de fluorescence.
Les particules lentivirales LentiBrite GFP-LC3 d'EMD Millipore apportent une fluorescence intense et une localisation précise pour permettre l'analyse de l'autophagie sur cellules vivantes dans les types cellulaires difficiles à transfecter.
Application
Fluorescence Microscopy Imaging:
(See Figure 1 in datasheet)
HT-1080 cells were plated in a chamber slide and transduced with lentiviral particles at an MOI of 20 for 24 hours. After media replacement and 48 hours further incubation, cells were either left in complete media or incubated for 4 hours in EBSS containing a lysosome inhibitor, to induce autophagy and inhibit lysosomal degradation of autophagosomes.
Cells were fixed with formaldehyde and mounted. Images were obtained by oil immersion wide-field fluorescence microscopy. The GFP-LC3 displays a diffuse nuclear and cytosolic distribution in fed cells, and a punctate distribution in starved autophagic cells.
Immunocytochemistry Comparison and Inhibitor Analysis:
(See Figure 2 in datasheet)
Similar to Figure 1 (see datasheet), HeLa cells were plated in a chamber slide and transduced with lentiviral particles at an MOI of 20 for 24 hours. After media replacement and 48 hours further incubation, cells were either left in complete media, incubated for 4 hours in EBSS containing a lysosome inhibitor to induce autophagy and inhibit lysosomal degradation, or incubated as in, with the addition of 5 mM 3-methyladenine (3-MA) as an inhibitor of autophagy. 3-MA completely blocks formation of GFP-LC3-positive autophagic punctae. Immunocytochemical staining (red) of the same fields of view with a monoclonal antibody against LC3A reveals similar expression patterns to the GFP-protein (green), although signal is diminished following 3-MA treatment.
Hard-to-transfect Cell Types:
(See Figure 3 in datasheet)
Primary cell types HUVEC or HuMSC were plated in chamber slides and transduced with lentiviral particles at an MOI of 40 for 24 hours. Subsequent treatments for cells left in complete media or cells incubated in EBSS with lysosome inhibitor, were performed as in Figures 1A and 1B (see datasheet).
Time-lapse Imaging:
(See Figure 5 in datasheet and video online)
HT-1080 cells were treated as in Figure 1B. Shortly following initiation of starvation conditions, time-lapse imaging was performed under temperature-controlled oil immersion wide-field fluorescence microscopy, with images taken every 1 minute over the course of 2 hours. Images demonstrate the translocation of GFP-LC3 from diffuse nuclear/cytosolic localization to discrete cytoplasmic puncta.
Fluorescence Microscopy Imaging:
Cardiomyocytes were cultured on laminin-coated glass bottom dishes in standard medium and transduced with lentiviral particles at a multiplicity of infection of 50. Lentiviral particles carrying a construct of TagGFP2-LC3 driven by the elongation factor-1 promoter (Cat. # 17-10193) were applied for 24 h, the medium was changed and the pharmacological treatment was started after another 24 h. Live images were obtained by using an inverted microscope, 40× objective and a digital camera (Dimitrakis, P., et al. (2012) Cell Tissue Res. 350:361–372).
For optimal fluorescent visualization, it is recommended to analyze the target expression level within 24-48 hrs after transfection/infection for optimal live cell analysis, as fluorescent intensity may dim over time, especially in difficult-to-transfect cell lines. Infected cells may be frozen down after successful transfection/infection and thawed in culture to retain positive fluorescent expression beyond 24-48 hrs. Length and intensity of fluorescent expression varies between cell lines. Higher MOIs may be required for difficult-to-transfect cell lines.
(See Figure 1 in datasheet)
HT-1080 cells were plated in a chamber slide and transduced with lentiviral particles at an MOI of 20 for 24 hours. After media replacement and 48 hours further incubation, cells were either left in complete media or incubated for 4 hours in EBSS containing a lysosome inhibitor, to induce autophagy and inhibit lysosomal degradation of autophagosomes.
Cells were fixed with formaldehyde and mounted. Images were obtained by oil immersion wide-field fluorescence microscopy. The GFP-LC3 displays a diffuse nuclear and cytosolic distribution in fed cells, and a punctate distribution in starved autophagic cells.
Immunocytochemistry Comparison and Inhibitor Analysis:
(See Figure 2 in datasheet)
Similar to Figure 1 (see datasheet), HeLa cells were plated in a chamber slide and transduced with lentiviral particles at an MOI of 20 for 24 hours. After media replacement and 48 hours further incubation, cells were either left in complete media, incubated for 4 hours in EBSS containing a lysosome inhibitor to induce autophagy and inhibit lysosomal degradation, or incubated as in, with the addition of 5 mM 3-methyladenine (3-MA) as an inhibitor of autophagy. 3-MA completely blocks formation of GFP-LC3-positive autophagic punctae. Immunocytochemical staining (red) of the same fields of view with a monoclonal antibody against LC3A reveals similar expression patterns to the GFP-protein (green), although signal is diminished following 3-MA treatment.
Hard-to-transfect Cell Types:
(See Figure 3 in datasheet)
Primary cell types HUVEC or HuMSC were plated in chamber slides and transduced with lentiviral particles at an MOI of 40 for 24 hours. Subsequent treatments for cells left in complete media or cells incubated in EBSS with lysosome inhibitor, were performed as in Figures 1A and 1B (see datasheet).
Time-lapse Imaging:
(See Figure 5 in datasheet and video online)
HT-1080 cells were treated as in Figure 1B. Shortly following initiation of starvation conditions, time-lapse imaging was performed under temperature-controlled oil immersion wide-field fluorescence microscopy, with images taken every 1 minute over the course of 2 hours. Images demonstrate the translocation of GFP-LC3 from diffuse nuclear/cytosolic localization to discrete cytoplasmic puncta.
Fluorescence Microscopy Imaging:
Cardiomyocytes were cultured on laminin-coated glass bottom dishes in standard medium and transduced with lentiviral particles at a multiplicity of infection of 50. Lentiviral particles carrying a construct of TagGFP2-LC3 driven by the elongation factor-1 promoter (Cat. # 17-10193) were applied for 24 h, the medium was changed and the pharmacological treatment was started after another 24 h. Live images were obtained by using an inverted microscope, 40× objective and a digital camera (Dimitrakis, P., et al. (2012) Cell Tissue Res. 350:361–372).
For optimal fluorescent visualization, it is recommended to analyze the target expression level within 24-48 hrs after transfection/infection for optimal live cell analysis, as fluorescent intensity may dim over time, especially in difficult-to-transfect cell lines. Infected cells may be frozen down after successful transfection/infection and thawed in culture to retain positive fluorescent expression beyond 24-48 hrs. Length and intensity of fluorescent expression varies between cell lines. Higher MOIs may be required for difficult-to-transfect cell lines.
Domaine de recherche
Apoptose et cancer
Neurosciences
Apoptose et cancer
Neurosciences
Sous-domaine de recherche
Apoptose - Autre
Maladies neurodégénératives
Apoptose - Autre
Maladies neurodégénératives
Composants
Lentivirus TagGFP2-LC3 :
un flacon contenant 25 µl de particules lentivirales correspondant à au moins 3 × 10e8 unités infectieuses (UI) par ml.
Pour obtenir des informations sur les titres spécifiques d'un lot, veuillez consulter le “Viral Titer (titre viral)” figurant dans les caractéristiques du produit sur la fiche technique.
Promoteur
EF-1 (facteur d'élongation 1)
Multiplicité d'infection (MOI)
MOI = rapport entre le nombre de particules lentivirales infectieuses (UI) et le nombre de cellules infectées.
Les valeurs de MOI permettant d'obtenir une grande efficacité de transduction et un signal de forte intensité pour les neurones se situent généralement dans la plage de 20 à 40. Pour cette cible, certains types cellulaires peuvent nécessiter des valeurs de MOI plus faibles (p. ex. : HT-1080, HeLa, cellules souches mésenchymateuses humaines (HuMSC)), tandis que d'autres peuvent nécessiter des valeurs de MOI plus élevées (p. ex. : cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVEC), U2OS).
REMARQUE : la valeur de MOI doit être titrée et optimisée par l'utilisateur final pour chaque type cellulaire et chaque cible lentivirale afin d'atteindre l'efficacité de transduction et l'intensité du signal souhaitées.
un flacon contenant 25 µl de particules lentivirales correspondant à au moins 3 × 10e8 unités infectieuses (UI) par ml.
Pour obtenir des informations sur les titres spécifiques d'un lot, veuillez consulter le “Viral Titer (titre viral)” figurant dans les caractéristiques du produit sur la fiche technique.
Promoteur
EF-1 (facteur d'élongation 1)
Multiplicité d'infection (MOI)
MOI = rapport entre le nombre de particules lentivirales infectieuses (UI) et le nombre de cellules infectées.
Les valeurs de MOI permettant d'obtenir une grande efficacité de transduction et un signal de forte intensité pour les neurones se situent généralement dans la plage de 20 à 40. Pour cette cible, certains types cellulaires peuvent nécessiter des valeurs de MOI plus faibles (p. ex. : HT-1080, HeLa, cellules souches mésenchymateuses humaines (HuMSC)), tandis que d'autres peuvent nécessiter des valeurs de MOI plus élevées (p. ex. : cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVEC), U2OS).
REMARQUE : la valeur de MOI doit être titrée et optimisée par l'utilisateur final pour chaque type cellulaire et chaque cible lentivirale afin d'atteindre l'efficacité de transduction et l'intensité du signal souhaitées.
Qualité
Évaluée par transduction de cellules HT-1080 et imagerie en fluorescence, afin d'évaluer l'efficacité de la transduction.
Forme physique
Précipitation au PEG
Stockage et stabilité
Manipulation et stockage
Stocké à -80 °C, le lentivirus est stable pendant au moins 4 mois à compter de la date de réception. Après la première décongélation, placer immédiatement sur de la glace et congeler sous forme d'aliquotes de travail à -80 °C. Les aliquotes congelées peuvent être conservées au moins 2 mois. Des congélations/décongélations supplémentaires peuvent entraîner une baisse du titre viral et de l'efficacité de la transduction.
REMARQUE IMPORTANTE CONCERNANT LA SÉCURITÉ
Les vecteurs lentiviraux à réplication défaillante, tels que le vecteur de 3e génération fourni dans ce produit, ne sont pas connus pour causer des maladies, que ce soit chez l'Homme ou chez l'animal. Cependant, les lentivirus peuvent s'intégrer dans le génome de la cellule hôte, et ainsi présenter un certain risque de mutagenèse par insertion. Ce produit fait partie du groupe de risque de niveau 2 et doit être manipulé dans un laboratoire de sécurité biologique de niveau 2 (LSB2). Une discussion détaillée sur la biosécurité des vecteurs lentiviraux est disponible sous la référence bibliographique suivante : Pauwels, K. et al. (2009). "State-of-the-art lentiviral vectors for research use: Risk assessment and biosafety recommendations." Curr. Gene Ther. 9: 459-474
Stocké à -80 °C, le lentivirus est stable pendant au moins 4 mois à compter de la date de réception. Après la première décongélation, placer immédiatement sur de la glace et congeler sous forme d'aliquotes de travail à -80 °C. Les aliquotes congelées peuvent être conservées au moins 2 mois. Des congélations/décongélations supplémentaires peuvent entraîner une baisse du titre viral et de l'efficacité de la transduction.
REMARQUE IMPORTANTE CONCERNANT LA SÉCURITÉ
Les vecteurs lentiviraux à réplication défaillante, tels que le vecteur de 3e génération fourni dans ce produit, ne sont pas connus pour causer des maladies, que ce soit chez l'Homme ou chez l'animal. Cependant, les lentivirus peuvent s'intégrer dans le génome de la cellule hôte, et ainsi présenter un certain risque de mutagenèse par insertion. Ce produit fait partie du groupe de risque de niveau 2 et doit être manipulé dans un laboratoire de sécurité biologique de niveau 2 (LSB2). Une discussion détaillée sur la biosécurité des vecteurs lentiviraux est disponible sous la référence bibliographique suivante : Pauwels, K. et al. (2009). "State-of-the-art lentiviral vectors for research use: Risk assessment and biosafety recommendations." Curr. Gene Ther. 9: 459-474
Informations légales
CHEMICON is a registered trademark of Merck KGaA, Darmstadt, Germany
Code de la classe de stockage
10 - Combustible liquids
Classe de danger pour l'eau (WGK)
WGK 2
Certificats d'analyse (COA)
Recherchez un Certificats d'analyse (COA) en saisissant le numéro de lot du produit. Les numéros de lot figurent sur l'étiquette du produit après les mots "Lot" ou "Batch".
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Fluorescent lentiviral particles encoding important GFP/RFP fusion proteins related to autophagy, apoptosis, and cell structure that enables live cell imaging.
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