RT-qPCR (PCR quantitative après transcription inverse)
La RT-qPCR, ou PCR quantitative après transcription inverse, combine les effets de la transcription inverse et de la PCR quantitative, ou PCR en temps réel, pour amplifier et détecter des cibles spécifiques. La RT-qPCR trouve de multiples applications, notamment dans la quantification du niveau d'expression génique, la validation de l'interférence par ARN ou la détection d'agents pathogènes comme les virus. Pour produire un signal fluorescent permettant de mesurer la quantité d'ADN en RT-qPCR, on utilise généralement des sondes d'hydrolyse comme les sondes TaqMan® ou un colorant se fixant sur l'ADN double brin comme le colorant SYBR® Green.
Qu'est-ce que la RT-qPCR ?
La PCR quantitative après transcription inverse (RT-qPCR) est une technique de détection et de quantification de l'ARN. Elle consiste à réaliser une transcription inverse de l'ARN total ou de l'ARN messager (ARNm) en ADN complémentaire (ADNc) au moyen de l'enzyme transcriptase inverse, suivie d'une amplification et d'une détection de cibles spécifiques de cet ADNc selon une technique appelée PCR quantitative (qPCR) ou PCR en temps réel. À chaque cycle de cette PCR, la quantité d'ADN est mesurée en temps réel par diverses réactions de fluorescence. Les méthodes les plus couramment utilisées pour produire un signal fluorescent consistent à utiliser des sondes d'hydrolyse comme les sondes TaqMan® ou un colorant se fixant sur l'ADN double brin comme le colorant SYBR® Green.
Le choix de la réaction de fluorescence dépend de différents facteurs tels que l'application, le coût et le format simplex ou multiplex du test. Les colorants se fixant à l'ADN sont recommandés pour les tests simplex à bas débit, car ils sont plus faciles à concevoir, permettent une mise en place plus rapide et sont plus économiques. Les sondes fluorescentes sont plus fréquemment utilisées dans les tests multiplex à haut débit qui requièrent une plus grande spécificité.
Pour en savoir plus, nous vous invitons à consulter notre guide technique sur la PCR quantitative.
Applications de la RT-qPCR
La RT-qPCR est utilisée dans un large éventail d'applications pour :
- quantifier le niveau d'expression génique
- valider l'interférence par ARN afin d'étudier la perte de fonction de gènes sélectifs
- détecter des agents pathogènes, comme les virus, pour le diagnostic de maladies infectieuses
- détecter des organismes génétiquement modifiés (OGM)
Comparaison de la RT-qPCR en une ou deux étapes
La RT-qPCR se réalise en une seule ou en deux étapes. Différents facteurs entrent en ligne de compte dans le choix de la bonne méthode de RT-qPCR. Il s'agit notamment du coût, de l'application et du type de test.
Figure 1.Schéma comparatif des procédés de RT-qPCR en une et deux étapes.
RT-qPCR en une étape
Dans la RT-qPCR en une étape, la transcription inverse ou la synthèse d'ADNc et la qPCR sont réalisées dans un même tube avec des amorces spécifiques de la séquence pour l'amplification d'une cible spécifique. Les tests en une étape utilisent souvent des transcriptases inverses génétiquement modifiées en raison de leur tolérance aux hautes températures nécessaires à l'hybridation des amorces spécifiques de la séquence. Un test en une étape est préférable pour la quantification répétée d'un même gène, notamment dans les applications à haut débit et les applications diagnostiques. La qualité et la rareté de l'ARN sont deux autres facteurs à prendre en compte dans le choix d'un test en une étape. Étant donné que l'ADNc synthétisé pendant la réaction ne peut être conservé séparément en aliquote, d'autres échantillons de l'ARN d'origine peuvent être nécessaires pour répéter le test.
RT-qPCR en deux étapes
Dans la RT-qPCR en deux étapes, les réactions de transcription inverse et de qPCR sont réalisées dans des tubes séparés avec des tampons et des réactifs distincts. Les tests en deux étapes peuvent utiliser des hexamères aléatoires, des amorces oligo(dT) et/ou des amorces spécifiques d'un gène. L'utilisation de tampons et de réactifs distincts permet de disposer d'un plus large choix de transcriptases inverses et de réactifs de PCR, et donc, d'une plus grande marge de manœuvre pour optimiser et améliorer l'efficacité de l'amplification des matrices difficiles. L'ADNc plus stable qui est synthétisé lors de la première étape peut ensuite être concentré et/ou purifié en vue d'une utilisation ultérieure ; il peut également servir à quantifier différents gènes à partir du même échantillon.
Pour en savoir plus sur l'optimisation des tests de PCR, nous vous invitons à consulter la page PCR Assay Optimization and Validation.
Produits de RT-qPCR en une étape pour les applications à haut débit
Nos produits de RT-qPCR en une étape combinent l'effet d'une transcriptase inverse à celui d'un anticorps anti-Taq à démarrage à chaud dans des mélanges pour PCR prêts à l'emploi (mélanges ReadyMix™), pour les applications utilisant des sondes ou le colorant SYBR® Green. Indépendamment de la réaction de détection ou de la présence de structures secondaires complexes, nos mélanges pour PCR ReadyMix™ sont spécialement formulés pour donner de meilleurs résultats en moins d'étapes.
Ils s'intègrent facilement dans votre procédure de PCR et se déclinent en un large choix de produits sur lesquels vous pouvez compter pour vos expériences de RT-qPCR en une étape. Vous ne pouvez pas vous tromper ! Découvrez les produits KiCqStart® et trouvez un mélange ReadyMix™ optimisé pour votre instrument, ou explorez nos solutions JumpStart™ pour des kits adaptables aux besoins de votre expérience. Pour la quantification d'ARN en une étape, à cycles rapides et à haut débit avec des sondes fluorogènes spécifiques de la séquence, choisissez le kit universel KAPA PROBE FAST. Optez en toute confiance pour l'un de nos produits de RT-qPCR, sans transiger sur la qualité.
Mélange ReadyMix™ KiCqStart® pour RT-qPCR en une étape avec sondes (compatible avec les principaux instruments de qPCR)
Nos réactifs ReadyMix™ KiCqStart® pour RT-qPCR en une étape avec sondes comportent un mécanisme de démarrage à chaud en conditions stringentes pour une plus grande spécificité, et sont formulés pour être hautement tolérants aux inhibiteurs de PCR présents dans les échantillons. Ces mélanges maîtres ultrasensibles prêts à l'emploi sont conçus pour être faciles à utiliser et contiennent tous les composants de base nécessaires à la réalisation d'une qPCR ou d'une RT-qPCR. Il vous suffit d'ajouter vos amorces, la sonde et de compléter avec l'eau pour former le cocktail réactionnel. C'est le produit idéal pour une qPCR rapide ou classique.
Consultez la liste complète des instruments compatibles ou découvrez nos sondes de qPCR sur mesure.
Kit ReadyMix™ Taq JumpStart™ (optimisé pour les principaux instruments de qPCR)
Nos produits ReadyMix™ Taq JumpStart™ pour RT-qPCR cumulent les avantages de la transcriptase inverse du virus de la leucémie murine de Moloney (M-MLV ou M-MuLV) et ceux de notre Taq polymérase JumpStart™ inactivée par un anticorps. La transcriptase inverse du M-MLV est une enzyme robuste qui est capable de transcrire des ARN à structures secondaires complexes, même à haute température, tandis que notre Taq polymérase JumpStart™ offre une spécificité et une sensibilité supérieures, comparée à une Taq polymérase standard. Ces produits sont compatibles avec les instruments à tubes ou à plaques ainsi qu'avec les instruments à capillaires.
Économisez 20 % sur le kit ReadyMix™ pour RT-qPCR (QR0200) lors du paiement à l'aide du code SGX.
Kit KAPA PROBE FAST (compatible avec toutes les technologies à sondes fluorogènes)
Le kit universel KAPA PROBE FAST One-Step avec mélange maître pour RT-qPCR en une étape est une solution sensible et pratique pour la réalisation de PCR en temps réel avec de l'ARN comme matrice. Il est conçu pour la quantification d'ARN en une étape, à cycles rapides et à haut débit avec des sondes fluorogènes spécifiques de la séquence. Ce kit est compatible avec toutes les technologies à sondes fluorogènes, notamment les sondes d'hybridation [p. ex., les sondes de transfert d'énergie de fluorescence par résonance (FRET)], les sondes d'hydrolyse (p. ex., les sondes TaqMan®) et les sondes de déplacement (p. ex., les balises moléculaires).
Il s'agit d'un cocktail prêt à l'emploi contenant tous les composants nécessaires à la réalisation d'une PCR en temps réel à cycles rapides avec sondes, à l'exception des amorces, de la ou des sondes et de la matrice. Le kit inclut le mélange maître pour qPCR KAPA PROBE FAST, les colorants de référence ROX High et ROX Low, le mélange KAPA RT et des dUTP.
Kit ABScript II pour RT-qPCR en une étape avec sondes (compatible avec les principaux instruments de qPCR)
La transcriptase inverse ABScript II contenue dans ce kit assure une transcription inverse fiable de l'ARN. Une fois la transcription inverse effectuée, la version à démarrage à chaud de la Taq polymérase est activée à 95 °C tandis que la transcriptase inverse ABScript II est simultanément inactivée. Lors de la PCR séquentielle, l'activité exonucléase 5'-3' de la Taq polymérase clive la sonde hybridée, séparant le rapporteur de l'extincteur et émettant un signal fluorescent.
Le kit ABScript II pour RT-qPCR en une étape avec sondes est un kit prêt à l'emploi qui permet de réaliser une transcription inverse et une qPCR avec sondes dans un seul et même tube. Il se présente dans un format modulable avec deux concentrations distinctes (50 ×) du colorant ROX (référence passive), à ajouter selon les besoins de chaque instrument de qPCR.
Produit réservé à une utilisation en recherche. Ne pas utiliser à des fins diagnostiques.
Produits de RT-qPCR en deux étapes pour une plus grande flexibilité
Nous proposons tous les réactifs nécessaires à la réalisation d'une transcription inverse suivie d'une analyse par PCR de l'ADNc synthétisé, dans des tubes séparés. Vous bénéficiez ainsi d'une plus grande flexibilité pour la conduite de vos expériences. Intégrez nos produits de RT-qPCR en deux étapes en toute confiance dans votre procédure de PCR, sans transiger sur la flexibilité. Grâce à la fiabilité de nos produits de PCR et aux multiples possibilités qu'ils vous offrent, vous ne pouvez pas vous tromper !
Kits et mélanges pour la synthèse d'ADNc
Pour répondre à vos besoins de transcription inverse, vous avez le choix entre différents types d'enzymes déclinés en plusieurs conditionnements. Tous ces produits contiennent les réactifs nécessaires à la synthèse du premier brin et sont proposés soit sous forme de kits (réactifs séparés) à des fins d'optimisation, soit sous forme de mélanges complets pour une synthèse simple et rapide du premier brin.
Transcriptases inverses (RT)
Parcourez notre collection de transcriptases inverses pour trouver celle qui convient à la complexité de votre ARN transcrit. Nos produits comprennent des transcriptases inverses du virus de la myéloblastose aviaire (AMV) et du virus de la leucémie murine de Moloney (M-MLV ou M-MuLV) déclinées en versions standard et améliorée (plus grande sensibilité).
Besoins de résoudre un problème de RT-qPCR ? Rendez-vous sur notre page RT-PCR / RT-qPCR Troubleshooting (résolution des problèmes en RT-PCR/RT-qPCR).
Kits de qPCR
Ces produits ReadyMix™ contiennent tous les composants nécessaires à la réalisation d'une qPCR. Il vous suffit d'ajouter le réactif de détection par fluorescence, les amorces et la matrice.
qPCR avec sondes
La qPCR avec sondes repose sur la détection spécifique d'une séquence d'un produit de PCR d'intérêt. Contrairement aux méthodes de qPCR avec SYBR® Green qui détectent l'intégralité de l'ADN double brin, la qPCR avec sondes utilise une sonde marquée par fluorescence spécifique de la cible, augmentant ainsi la spécificité et la sensibilité de la réaction. De plus, compte tenu du large choix de colorants fluorescents disponibles, il est possible d'utiliser plusieurs amorces pour amplifier un grand nombre de séquences simultanément.
qPCR avec SYBR® Green
SYBR® Green I est un colorant fluorescent couramment utilisé pour la visualisation de l'ADN qui se fixe sur tous les ADN doubles brins. La détection s'effectue par la mesure de l'augmentation de la fluorescence sur l'ensemble du cycle. Le colorant SYBR® Green I présente des pics d'excitation et d'émission de respectivement 494 nm et 521 nm. La spécificité de notre détection par qPCR avec SYBR® Green est considérablement améliorée par l'incorporation d'une Taq polymérase à démarrage à chaud, comme la Taq JumpStart™.
Nous vous invitons à visionner cette courte vidéo pour en savoir plus sur la qPCR avec SYBR® Green.
RT-qPCR appliquée aux micro-ARN
Grâce à notre gamme de produits MystiCq®, trouvez les produits qu'il vous faut pour la transcription inverse de micro-ARN.
Système MystiCq® pour RT-qPCR de micro-ARN
Avec les réactifs MystiCq® pour micro-ARN, vous disposez d'une procédure de RT-qPCR avec SYBR® Green complète pour une quantification de l'expression en seulement trois étapes :
- Isolement
- Synthèse d'ADNc
- Quantification par amplification
Pour en savoir plus, consultez notre page dédiée aux produits MystiCq® et découvrez leurs avantages :
- Plus de 1 400 couples d'amorces prédéfinies et testées en laboratoire, conçues pour ne cibler que les micro-ARN matures
- Conversion de tous les micro-ARN, permettant un nombre de lectures quasi illimité à partir d'un seul échantillon
- Trois produits au choix pour l'isolement des micro-ARN
Mise au point de tests de qPCR et réactifs pour la recherche sur le SARS-CoV-2
Nous avons à cœur de proposer aux chercheurs des ressources et des outils fiables afin de soutenir la lutte contre la COVID-19 (SARS-CoV-2). Pour répondre à leurs besoins avec des réactifs et des protocoles spécifiques au SARS-CoV-2, nos scientifiques ont évalué les kits de RT-qPCR en une étape qui utilisent des ARN pour la détection de cibles SARS-CoV-2. Produit réservé à une utilisation en recherche. Ne pas utiliser à des fins diagnostiques.
Protocole expérimental et méthodes
La présente expérience est conduite afin de déterminer si nos kits de RT-qPCR en une étape permettent de détecter le SARS-CoV-2. Le test est réalisé conformément au protocole de détection du SARS-CoV-2 établi par le Centre américain pour le contrôle et la prévention des maladies (CDC), en utilisant comme matrice de l'ARN de SARS-CoV-2 de synthèse dilué à 105, 104, 103, 102 et 10 copies. L'échantillon à analyser contient la matrice, les réactifs de chaque kit et les jeux de sondes TaqMan® et d'amorces d'ADN spécifiques des cibles N1 et N2 (N = gène de nucléocapside). Chaque test inclut également des échantillons témoins sans matrice (NTC pour "No Template Control").
Tableau 2. Jeux de sondes et d'amorces conçues pour la détection spécifique du SARS-CoV-2 (tests N1 et N2). Produit réservé à une utilisation en recherche. Ne pas utiliser à des fins diagnostiques.
Résultats des tests
A : test N1
B : test N2
Figure 2.Tests de détection du SARS-CoV-2 avec le kit de RT-PCR quantitative ReadyMix™ (réf. QR200) pour les cibles N1 (graphique A) et N2 (graphique B).
Les tests de détection des gènes N1 (graphique A) et N2 (graphique B) du SARS-CoV-2 illustrés sur la Figure 2 sont réalisés avec le kit de RT-PCR quantitative ReadyMix™ (réf. QR200) en utilisant comme matrice de l'ARN de SARS-CoV-2 de synthèse. Les deux tests se révèlent sensibles pour détecter la matrice dès la dilution de 102 copies. Aucune amplification n'est mise en évidence sur les échantillons NTC.
A : test N1
B : test N2
Figure 3.Tests de détection du SARS-CoV-2 avec le mélange ReadyMix™ KiCqStart® pour RT-qPCR en une étape avec sondes (réf. KCQS07) pour les cibles N1 (graphique A) et N2 (graphique B).
Les tests de détection des gènes N1 (graphique A) et N2 (graphique B) du SARS-CoV-2 illustrés sur la Figure 3 sont réalisés avec le mélange ReadyMix™ KiCqStart® pour RT-qPCR en une étape avec sondes (réf. KCQS07) en utilisant comme matrice de l'ARN de SARS-CoV-2 de synthèse. Les deux tests se révèlent sensibles pour détecter la matrice dès la dilution de 10 copies. Aucune amplification n'est mise en évidence sur les échantillons NTC.
A : test N1
B : test N2
Figure 4.Tests de détection du SARS-CoV-2 avec le kit universel KAPA PROBE FAST One-Step avec mélange maître pour RT-qPCR en une étape (concentré 2 ×) (réf. KK4752) pour les cibles N1 (graphique A) et N2 (graphique B).
Les tests de détection des gènes N1 (graphique A) et N2 (graphique B) du SARS-CoV-2 illustrés sur la Figure 4 sont réalisés avec le kit universel KAPA PROBE FAST One-Step avec mélange maître pour RT-qPCR en une étape (concentré 2 ×) (réf. KK4752) en utilisant comme matrice de l'ARN de SARS-CoV-2 de synthèse. Les deux tests se révèlent sensibles pour détecter la matrice dès la dilution de 102 copies. Aucune amplification n'est mise en évidence sur les échantillons NTC.
A : test N1
B : test N2
Figure 5.Tests de détection du SARS-CoV-2 avec le kit ABScript II pour RT-qPCR en une étape avec sondes (réf. RK20407) pour les cibles N1 (graphique A) et N2 (graphique B).
Les tests de détection des gènes N1 (graphique A) et N2 (graphique B) du SARS-CoV-2 illustrés sur la Figure 5 sont réalisés avec le kit ABScript II pour RT-qPCR en une étape avec sondes (réf. RK20407) en utilisant comme matrice de l'ARN de SARS-CoV-2 de synthèse. Les deux tests se révèlent sensibles pour détecter la matrice dès la dilution de 10 copies. Aucune amplification n'est mise en évidence sur les échantillons NTC.
Conclusion
Les résultats qui précèdent indiquent que nos kits et réactifs de RT-qPCR en une étape conviennent parfaitement à la détection de cibles SARS-CoV-2 pour la recherche sur le SARS-CoV-2. Il s'ensuit que les tests utilisant nos réactifs pour RT-qPCR en une étape permettent de détecter la matrice d'ARN diluée à seulement 100 copies, voire dans certains cas, dès 10 copies.
Produit réservé à une utilisation en recherche. Ne pas utiliser à des fins diagnostiques.
Les données non publiées présentées dans cet article technique sont issues de recherches internes.
Pour en savoir plus sur les produits de RT-qPCR pour la détection du SARS-CoV-2, nous vous invitons à consulter la page Sigma-Aldrich.com/covid19.
Réactif TRI® pour l'isolement de l'ARN total
Le réactif TRI® est idéal pour un isolement rapide, efficace et économique de l'ARN total, ou l'isolement simultané de l'ARN, de l'ADN et des protéines contenus dans des échantillons d'origine humaine, animale, végétale, levurienne, bactérienne ou virale.
Il s'agit d'un mélange de thiocyanate de guanidine et de phénol, dans une solution monophasique, qui dissout efficacement l'ADN, l'ARN et les protéines après homogénéisation ou lyse d'un échantillon tissulaire. Après ajout de chloroforme ou de 1-bromo-3-chloropropane et centrifugation, le mélange se sépare en 3 phases : une phase aqueuse contenant l'ARN, une phase intermédiaire contenant l'ADN et une phase organique contenant les protéines. Il est ensuite possible d'isoler chaque composant après séparation des phases. Un millilitre de réactif TRI® suffit pour isoler l'ARN, l'ADN et les protéines contenus dans 50 à 100 mg de tissu, 5 à 10 × 10⁶ cellules ou 10 cm2 d'une monocouche de cellules cultivées dans une boîte de Pétri.
Il s'agit d'une des méthodes les plus efficaces pour isoler l'ARN total et le protocole est réalisable en seulement 1 heure à partir de cellules ou de tissus frais. Il se révèle particulièrement efficace pour l'isolement de tout type de molécule d'ARN de 0,1 à 15 kb de long. On obtient un ARN intact, peu ou pas contaminé par de l'ADN ou des protéines, qui peut être utilisé pour des analyses par northern blotting, l'isolement d'ARNm, une traduction in vitro, un test de protection à la RNase, un clonage ou une PCR.
Le réactif TRI® a été largement utilisé dans plusieurs études pour l'inactivation des virus et l'extraction de l'ARN viral pour la détection du SARS-CoV-2 par RT-qPCR1,2,3. Il se révèle idéal pour l'isolement de micro-ARN et leur conservation prolongée à -80 °C4. Il a été utilisé pour extraire l'ARN de coronavirus félins et canins à des fins de RT-PCR5,6. Il a également servi à isoler l'ARN cytoplasmique contenu dans des cellules Vero infectées par le SARS-CoV. 7.
Produit réservé à une utilisation en recherche. Ne pas utiliser à des fins diagnostiques.
Références bibliographiques
* Cet article est une prépublication et n'a pas été soumis à un comité de lecture. Il fait état de nouvelles recherches médicales qui demandent encore à être évaluées et ne doit donc pas être utilisé pour guider la pratique clinique.
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