Schnelle Antikörper-Konzentration mit Amicon^®-Ultra-Zentrifugenfiltern

Einleitung

Aufreinigungsprotokolle für Immunglobuline umfassen im Allgemeinen die Affinitätsbindung an Protein-A- oder Protein-G-Chromatographie-Medien, das Waschen ungebundener Proteine und Eluieren mit einem Puffer mit niedrigem pH-Wert. Die resultierenden aufgereinigten Antikörper sind häufig zu stark verdünnt, um noch für anschließende Untersuchungen oder eine Langzeitlagerung in Frage zu kommen. Häufig ist eine Dialyse erforderlich, um die Antikörper zu konzentrieren und/oder den Puffer gegen einen die Proteinaktivität erhaltenden Puffer auszutauschen. Mit der Ultrafiltration wird das gleiche Ergebnis bei einer Immunglobulin-Rückgewinnungsrate von bis zu 99 % und einer einstufigen Salzentfernung (siehe Protokoll „Konzentration, Entsalzung und Pufferaustausch“) schneller erzielt.

Methode und Ergebnisse

Aufreinigung und Konzentration von Kaninchen-IgG mit Prosep^®-A- und Prosep^®-G-Montage^®-Antikörper-Aufreinigungskits und Amicon^®-Ultra-15-ml-Zentrifugenfiltern.

A. Aufreinigen von IgG mittels Montage^® Kits

1. Die Prosep^®-A- oder Prosep^®-G-Harze mit 10 ml Bindepuffer äquilibrieren und 5 Minuten lang bei 500 x g zentrifugieren.
2. Die Serumprobe mittels Filterung durch einen Steriflip^®-GP-0,22-µm-Filter vorklären.
3. Die Probe im Verhältnis von 1:1 mit Bindepuffer A verdünnen und 20 Minuten lang bei 100 bis 150 x g zentrifugieren.
4. Die Spin-Säule mit 20 ml Bindepuffer A waschen, um ungebundene Verunreinigungen mittels 5-minütiger Zentrifugation der Säule bei 500 x g zu entfernen.
5. Die Proben eluieren. Hierzu 10 ml Elutionspuffer B2 in ein neues Zentrifugenröhrchen mit 1,3 ml Neutralisierungspuffer geben.
6. Die Gesamtprotein-Konzentration der Probe mittels einer geeigneten Konzentrationsmethode messen (z. B. UV-Absorption bei 280 nm).

B. Konzentrieren von IgG mittels Amicon^®-Ultra-15-30-kDa-MWCO-Einheiten

1. Die neutralisierte eluierte Fraktion in die Amicon^®-Ultra-15-ml-30-kDa-MWCO-Einheit geben.
2. 10 bis 20 Minuten lang bei 4.000 x g in einer Zentrifuge mit Ausschwingrotor oder bei 5.000 x g in einer Zentrifuge mit Festwinkelrotor zentrifugieren, bis die Probe die gewünschte Konzentration erreicht hat.