Eine einfache Vorgehensweise zur Proteinanreicherung mittels Ultrafiltration

Das menschliche Plasma-Proteom ist eine umfangreiche Ressource für die Biomarker-Identifizierung und -Untersuchung. Die Gelfiltration dient traditionell zur größenbasierten Fraktionierung von Proteinlösungen^1, 2. Allerdings ist die Gelfiltration aufwendig, durch die Probengröße eingeschränkt und zeitintensiv. Außerdem wird die Probe dabei erheblich verdünnt. Diese Einschränkungen können durch die Ultrafiltration überwunden werden. Dies zeigt sich in der Literatur^3–5, wo die Ultrafiltration als Probenvorbereitungsmethode bei Vorbereitung von Fraktionen mit niedrigem Molekulargewicht (< 10 kDa) für Biomarkeranalysen verwendet wurde. Hierbei wurden Amicon^®-Ultra-Einheiten genutzt, um Cytochrom c aus einem Gemisch mit 10 % fetalem Kälberserum aufzureinigen.

Methode

Bei diesem Versuchsaufbau dienten Ultrafiltrationseinheiten dazu, sowohl Fraktionen mit niedrigem Molekulargewicht (LMW; Low Molecular Weight) als auch Fraktionen mit hohem Molekulargewicht (HMW; High Molecular Weight) aus Serum anzureichern. Mithilfe eines seriellen Filtrationsansatzes (Abbildung 1) wurden die Proteine durch eine Verringerung des Molekulargewichtsgrenzwerts (MWCO; Molecular Weight Cut-Off) in Amicon^®-Ultra-4-ml-Einheiten von 100 kDa bis 10 kDa MWCO fraktioniert.

Ergebnisse

Diese Vorgehensweise der seriellen Anreicherung ermöglichte eine Protein-Kompartimentierung und steigerte den Durchsatz im Vergleich zur direkten Filtration mittels einer Einheit mit niedrigerem MWCO (Abbildung 2, oben). Die mit der Anreicherungsstrategie vorbereiteten Proben wiesen außerdem eine höhere Reinheit auf als bei der traditionellen direkten Filtration (Abbildung 3, oben). Die Daten zeigen, dass eine serielle Ultrafiltration ein geeigneter Ansatz für eine größenbasierte Proteinanreicherung ist.

Literatur

1. Werner M. 1966. Fractionation of lipoproteins from blood by gel filtration. Journal of Chromatography A. 2563-70. https://doi.org/10.1016/s0021-9673(01)98217-2

2. Kent U. 1999. Purification of Antibodies Using Ammonium Sulfate Fractionation or Gel Filtration. Javois L.C. Immunocytochemical Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. 115(1):11-18.

3. Schulz-Knappe P, Schrader M, Ständker L, Richter R, Hess R, Jürgens M, Forssmann W. 1997. Peptide bank generated by large-scale preparation of circulating human peptides. Journal of Chromatography A. 776(1):125-132. https://doi.org/10.1016/s0021-9673(97)00152-0

4. Basso D, Valerio A, Seraglia R, Mazza S, Piva MG, Greco E, Fogar P, Gallo N, Pedrazzoli S, Tiengo A, et al. 2002. Putative Pancreatic Cancer-Associated Diabetogenic Factor: 2030 MW Peptide. Pancreas. 24(1):8-14. https://doi.org/10.1097/00006676-200201000-00002

5. Prazeres S, Santos MA, Ferreira HG, Sobrinho LG. 2003. A practical method for the detection of macroprolactinaemia using ultrafiltration. 58(6):686-690. https://doi.org/10.1046/j.1365-2265.2003.01721.x