Probenvorbereitung & Fehlersuche in der Gelelektrophorese

Elektrische Ströme, Drähte, Leitungen, Kämme, Lecks... es gibt so viele Problemursachen. Wir verwenden nach wie vor Gele, da die Elektrophorese immer noch ein wirksames Verfahren für die Trennung von Proteinen ist, sodass die Ergebnisse des Antikörper-basierten Immunnachweises sehr eindeutig sein können.

Klicken Sie auf die Themen Probenvorbereitung & Gelelektrophorese, um mehr über die möglichen Ursachen und Abhilfemaßnahmen zu erfahren:

• Keine Banden oder Gelfront
  
• Probe sinkt nicht auf den Boden des Wells
  
• Probe tritt aus dem Well aus
  
• Banden sind vertikal verschmiert
  
• Zu viele Banden
  
• Gel läuft ungewöhnlich langsam durch
  
• Gel läuft ungewöhnlich schnell durch
  
• Proteinbanden liegen zu nah nebeneinander (nicht vollständig getrennt)
  
• Die Gelbanden links oder rechts außen sind verzerrt
  
• Die Banden bilden „lächelnde“ Formen

Keine Banden oder Gelfront

Mögliche Ursache	Abhilfe
Proteine sind aus dem Gel gelaufen	Die Gellaufzeit verringern. Die Spannung verringern. Sicherstellen, dass die Kabel richtig ausgerichtet sind, da die Elektrophoresekabel zur Stromversorgung vertauscht sein können, wodurch das Gel nach oben läuft. Den Acrylamidanteil des Gels erhöhen.
Die Gelmenge zur Beladung des Proteins war zu niedrig	Die Proteinmenge pro Well erhöhen. Sicherstellen, dass die Proteinkonzentration jeder Probe genau ist.
Die Probe ist vor dem Einschalten der Stromversorgung aus dem Well diffundiert	Den Zeitraum zwischen dem Beladen des ersten Gel-Wells und dem Beginn der Elektrophorese verringern. Falls erforderlich, weniger Gele und/oder weniger Bahnen auf einmal durchlaufen lassen.
Nicht ausreichend SDS in der Probe	Ohne ausreichend SDS sind die Proteine nicht negativ geladen und können nicht durch die Zelle wandern. Für eine angemessene SDS-Konzentration sorgen.

Probe sinkt nicht auf den Boden des Wells

Mögliche Ursache	Abhilfe
Zu wenig Glycerin in der Probe	Die Glycerin-Konzentration erhöhen.

Probe tritt aus dem Well aus

Mögliche Ursache	Abhilfe
Wells wurden beim Entfernen des Kamms beschädigt	Den Gelkamm vorsichtig entfernen, damit die Wells nicht beschädigt werden. Die Wells vor dem Beladen der Proben vorsichtig mit Elektrophoresepuffer spülen, um beschädigte Wells zu erkennen.
Wells beim Beladen der Probe beschädigt	Die Probe vorsichtig beladen und darauf achten, dass die Pipettenspitze nicht den Boden oder die Seiten der Wells berührt.

Banden sind vertikal verschmiert

Mögliche Ursache	Abhilfe
Unvollständige Proteinlöslichkeit blockiert das Eindringen der Proteine in das Gel	Bei der Vorbereitung des Zelllysats auf eine angemessene Ultraschallbehandlung/Homogenisierung und Zentrifugation achten, um Feststoffteilchen zu entfernen.
Proteinabbau	Hinzufügen/Erhöhen der Konzentration von Protease-/Phosphatase-Inhibitoren während der Zelllysatvorbereitung. Wiederholte Gefrier-/Auftauzyklen von Zelllysat- und Western-Blot-Proben vermeiden.
Zu hohe Proteinbeladung Auswirkungen von zu hoher Proteinbeladung auf SDS-PAGE (Bahn rechts außen)	Die Proteinbeladung pro Well verringern. Eine genaue Proteinkonzentration der Probe sicherstellen.
Gel läuft zu schnell durch	Laufzeit des Gels erhöhen.
Schlechte Qualität oder altes Gel	Frisches Gel verwenden.

Zu viele Banden

Mögliche Ursache	Abhilfe
Proteinabbau	Hinzufügen/Erhöhen der Konzentration von Protease-/Phosphatase-Inhibitoren während der Zelllysatvorbereitung. Wiederholte Gefrier-/Auftauzyklen von Zelllysat- und Western-Blot-Proben vermeiden.
Proteinaggregation	Ausreichende DTT-Konzentration sicherstellen, durch die Disulfidbindungen reduziert werden. Western-Blot-Proben vor dem Beladen des Gels im Wasserbad erhitzen.

Gel läuft ungewöhnlich langsam durch

Mögliche Ursache	Abhilfe
Pufferkonzentration zu hoch	Puffer verdünnen.
Stromstärke zu niedrig	Spannung des Gelgeräts erhöhen.

Gel läuft ungewöhnlich schnell durch

Mögliche Ursache	Abhilfe
Puffer zu stark verdünnt	Puffer konzentrieren.
Stromstärke zu hoch	Die Spannung des Gelgeräts verringern.

Proteinbanden liegen zu nah nebeneinander (nicht vollständig getrennt)

Mögliche Ursache	Abhilfe
Unzureichende Laufzeit	Das Gel über einen längeren Zeitraum durchlaufen lassen.
Falsche Gel-Porengröße	Ein Gradientengel verwenden (höherer Acrylamidanteil unten als oben), durch das ein breiterer Größenbereich von Proteinen angemessen getrennt wird.

Die Gelbanden links oder rechts außen sind verzerrt

Mögliche Ursache	Abhilfe
Randeffekte	Keine Wells leer lassen. Nicht genutzte Wells mit einer geringen Menge Protein beladen, um Randeffekte auf benachbarte Bahnen zu vermeiden.

Die Banden bilden „lächelnde“ Formen

Mögliche Ursache	Abhilfe
Übermäßige Wärme Gel läuft in „lächelnder“ Form durch. Dies ist auf eine zu hohe Spannung zurückzuführen. Außerdem werden die Zielbanden gebleicht, weil das Nachweisreagenz in einer zu hohen Konzentration verwendet wird.	Das Gel bei niedrigerer Spannung über einen längeren Zeitraum laufen lassen. Gekühlte Puffer verwenden und das Gel in einem kalten Raum oder auf Eis gepackt durchlaufen lassen.