Auto2D^® Automatisches System für die 2-D-Gel-Elektrophorese

Wie funktioniert die 2-D-Gelelektrophorese? Eindimensionale Verfahren für die Protein-Gelelektrophorese wie SDS-PAGE werden routinemäßig im Labor durchgeführt; diese Methoden bieten eine geringe Trennfähigkeit. Durch die zweidimensionale Gelelektrophorese (2-DE) werden Proteine in komplexen Proben nach pI-Wert und Molekulargewicht getrennt, wodurch der direkte Vergleich von Hunderten oder Tausenden Proteinen gleichzeitig bei hoher Auflösung möglich wird. In Verbindung mit Analysesoftware, Immunnachweis oder Massenspektrometrieverfahren stellt 2-DE ein leistungsstarkes Werkzeug zur Unterstützung bei der Proteinidentifizierung und anderen proteomischen Analysen dar. Weitere Ressourcen und Produkte finden Sie auf unserer Seite zu Protein-Elektrophorese und Western Blotting.

• Vollautomatische 2-D-Gelelektrophorese
• Wie ist der Lauf eines 2-D-Gels mit dem Auto2D^® 2-D-Elektrophoresesystem?
• Warum wird die 2-D-Gelelektrophorese eingesetzt?
• Auto2D^® 2-D-Gelelektrophorese für Lebensmittelallergieanwendungen
• Auto2D^®-System zur Validierung von Anti-HCP-Antikörpern für ELISA und andere Immunassays
• Auto2D^®-System für die Antigen-Profilerstellung

Vollautomatische 2-D-Gelelektrophorese

Die zweidimensionale Gelelektrophorese gilt im Allgemeinen als schwierig und zeitaufwändig in der Durchführung, erfordert eine fortgeschrittene Schulung der Anwender und bietet eine geringe Reproduzierbarkeit sowie eine hohe Variabilität zwischen den Anwendern. Durch das Auto2D^® System wird die zweidimensionale Gelelektrophorese vollständig automatisiert. Die aufgetragene Probe gelangt passiv in das Gel der ersten Dimension und trennt die Proteine nach ihren isoelektrischen Punkten. Nach der Äquilibrierung wird das Gel der ersten Dimension auf ein horizontales SDS-PAGE-Gel gelegt, in dem die Proteine nach ihrem Molekulargewicht aufgelöst werden. Das Auto2D^® 2-D-Elektrophoresesystem ist benutzerfreundlich und ermöglicht eine zweidimensionale Elektrophorese in 1-2 Stunden, damit reproduzierbare Ergebnisse schneller zur Verfügung stehen. Zu den weiteren Merkmalen und Vorteilen des Auto2D^® 2-D-Elektrophoresesystems gehören:

• Einfach anzuwenden, es ist keine fortgeschrittene Schulung erforderlich
• Reduzierung der Ausfallzeiten im Labor durch eine zügige Workflow-Implementierung
• Geringere Variabilität zwischen Anwendern verbunden mit einer höheren Reproduzierbarkeit
• IQ/OQ-Unterstützung für die Einhaltung von GMP

WIE IST DER LAUF EINES 2-D-GELS MIT DEM MIT DEM Auto-2D^® 2-D-ELEKTROPHORESEGERÄT?

Durch das Auto2D^®-2-D-Elektrophoresesystem wird die zweidimensionale Gelelektrophorese vollständig automatisiert und die Proteinanalyse vereinfacht. Zudem werden konsistentere, reproduzierbare Anwender-unabhängige Ergebnisse erzielt. Durch die effiziente Technik des Auto2D^®-Systems wird der Zeitaufwand für das Laden der Proben, die isoelektrische Fokussierung, die Äquilibrierung und SDS-PAGE von 4–24 Stunden auf nur 1–2 Stunden reduziert. Dadurch ist das Auto2D^®-System im Vergleich zu anderen halbautomatischen 2-DE-Systemen auf dem Markt einzigartig.

Abbildung 1. Workflow der zweidimensionalen Gelelektrophorese und die durch das Auto2D® System automatisierten Schritte.

Warum wird die 2-D-Gelelektrophorese eingesetzt?

Das Auto2D^® 2-D-Elektrophoresesystem hat sich in zahlreichen Anwendungen bewährt. Beispiele für geeignete Anwendungen sind die differentielle Proteinexpressionsanalyse in der Krebsforschung und die Aufklärung von Krankheitsmechanismen. Weitere Anwendungen sind die Trennung aufgereinigter Proteine für die Kristallisation oder die Analyse posttranslationaler Modifikationen und 2-D Western Blotting in Forschungsbereichen wie der Allergieforschung oder der Analyse von Zellsignalwegen.

Abbildung 2. Links: Differenzielle Proteinexpressionsanalyse in kultivierten Zellen für die Krebsbiomarkerforschung. Grün steht für Proteine, die in normalen Zellen abundant vorkommen. Rot stellt krebsspezifische Proteinspots dar. Gelb stellt die Überlappung in der Proteinexpression dar. Rechts: Differenzielle Proteinexpression in Plasmaproben.

Abbildung 3. Links: Bewertung von Mikroheterogenitäten in therapeutischen Antikörperpräparaten. Durch das rote Dreieck sind Spots für den Zielantikörper gekennzeichnet; die unteren Flecken sind Regionen, in denen der Antikörper fehlt. Rechts: Proteinanalyse vor und nach der Aufreinigung. 2-DE kann verwendet werden, um zu prüfen, ob die Probe für die Kristallisation und die Röntgenstrukturanalyse homogen ist.

Abbildung 4. Proteine aus Mehlextrakt (nachgewiesen durch SYPRO Ruby) durch SDS-PAGE (A), WB: Anti-Gliadin-Antikörper durch SDS-PAGE (B) und Zusammenführung durch SDS-PAGE (C). Proteine aus Mehlextrakten (nachgewiesen mit SYPRO Ruby), Pfeile zeigen auf Spots, die mit dem Anti-Gliadin-Antikörper nachgewiesen wurden (D). WB mit Anti-Gliadin-Antikörper (E) und Zusammenführung (F).

Auto2D^® 2-D-Gelelektrophorese für Lebensmittelallergieanwendungen

Angesichts der großen und wachsenden Zahl von Menschen, die weltweit an Allergien leiden, ist es immer wichtiger, Allergene, insbesondere in Nahrungsmitteln, zu erkennen und zu identifizieren. Die zweidimensionale Gelelektrophorese (2D-E) wird traditionell für die hochauflösende Proteintrennung verwendet, die für die Immunerkennung allergener Proteine erforderlich ist. Dieses herkömmliche Trennverfahren ist jedoch oft zeitaufwändig und technisch anspruchsvoll. Unser Auto2D^®-System ermöglicht eine vollautomatische 2D-Elektrophorese in 1-2 Stunden mit schnellen und zuverlässigen Ergebnissen. Hier zeigen wir, dass unser Auto2D^®-System zur Identifizierung allergener Proteine aus verschiedenen Quellen geeignet ist.

Allergien sind ein weltweit auftretendes Gesundheitsproblem, mit diesen drei Allergen-Hauptquellen: Lebensmittel (geschätzte 4 % der Weltbevölkerung), pharmazeutische Arzneimittel (geschätzte 10 % der Bevölkerung) und Pflanzenpollen (geschätzte 10-30 % der Bevölkerung, Tendenz steigend) ^1-3. Allergische Reaktionen treten durch eine IgE-vermittelte Immunantwort auf und wurden traditionell mit einem Hautstichtest getestet. Heute können Allergentests und Diagnostik auch durch molekulare Ansätze erreicht werden¹. Der Radioallergosorbens-Test (RAST) und der Enzym-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) sind zwei Methoden zum Nachweis und zur Quantifizierung von IgE gegen spezifische Allergene. Da RAST und ELISA keinen Proteintrennungsschritt enthalten, kann eine Kreuzreaktivität zwischen Antikörpern und Lebensmittelmatrixkomponenten in einigen Fällen zu falsch-positiven Ergebnissen führen¹. 

Die Gelelektrophorese ist eine weit verbreitete Methode zur Proteintrennung. Während die standardmäßige eindimensionale Gelelektrophorese die Proteine basierend auf ihrem Molekulargewicht trennt, bietet die zweidimensionale Gelelektrophorese eine höhere Auflösung, indem sie Proteine auf Basis des isoelektrischen Punktes (pI) trennt. Diese erhöhte Auflösung ermöglicht es Forschenden, zwischen Proteinen zu unterscheiden, die ein ähnliches Molekulargewicht haben, insbesondere bei Isoformen, die unterschiedliche Allergenität aufweisen können. Die 2D-Gelelektrophorese-Technik zeigt auch geringe technische Variabilität, was sie zu einer guten Option für die Forschung hinsichtlich der Auswirkungen auf die menschliche Gesundheit macht, wie zum Beispiel die Identifizierung von Allergenen⁴.

2-D-Gelelektrophorese für den immunologischen Nachweis von Lebensmittelallergien

Die 2D-Gelelektrophorese und der anschließende immunologische Nachweis werden verwendet, um eine Vielzahl allergener Proteine aus verschiedenen Quellen zu identifizieren. In der Forschung an Pflanzenpollen hat man diese Technik eingesetzt, um neue IgE-bindende Proteine aus Roteichenpollen zu identifizieren und um klinisch relevante Allergene in einem natürlichen Grasextrakt zu bestätigen, einschließlich mehrerer Isoformen eines allergenen Proteins^5,6. Die 2D-Gelelektrophorese wurde in einer gründlichen Untersuchung der wichtigsten Erdnussallergenfamilien verwendet, in der verschiedene Erdnussstämme verglichen wurden. Sie wurde auch eingesetzt, um zu bestätigen, dass keine Unterschiede in den Allergenen zwischen natürlichen und genetisch veränderten Sojabohnen bestehen^7,8.

Hier demonstrieren wir den Nutzen des Auto2D^® Gelelektrophorese-Systems beim Nachweis von Allergenen aus vier Nahrungsquellen: drei Pflanzenquellen (Sojabohnen, Walnuss und Buchweizen) und eine tierische Quelle (Lachsrogen). Darüber hinaus wurde unser System erfolgreich zur Identifizierung spezifischer Allergene nach Immundetektion mit Patientenserum eingesetzt. Wir haben das Auto2D^®-System verwendet, um einzelne Banden von SDS-PAGE in mehrere unterschiedliche Proteinflecken aufzulösen, die den wichtigsten bekannten Allergenen in Sojabohnen- und Lachsrogenproben entsprechen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass das Auto2D^®-Gelelektrophorese-System zur Identifizierung von Allergenen verwendet werden kann, da es sowohl den Zeitaufwand als auch das nötige technische Know-how reduziert, während es dennoch hochwertige, zuverlässige Ergebnisse erzielt.

Auto2D^® 2-D für Anwendungen in Lebensmittelallergien – Ergebnisse

Sojabohnenextrakt wurde gewonnen, indem 2,5 g handelsübliche Sojabohnen über Nacht in 25 ml destilliertem Wasser eingeweicht, zermahlen und mit Gaze ausgedrückt wurden. Die Proteinkonzentration war ähnlich wie bei Sojamilch (ca. 30 µg/μl). Anschließend wurden 30 μg Probe mit dem Auto2D^®-System analysiert und 0,5 μl mit herkömmlicher SDS-PAGE. Für 2D-E mit dem Auto2D^®-System wurde IEF-Chip PH3-10NL als Erstdimension und PAGE-Chip 12,5 % als Zweitdimension ausgewählt. Die Probe wurde mit dem Standardprogramm (PH3-10NL M) durchgeführt. Nach der Elektrophorese wurden die Proteine in 1D SDS-PAGE und Auto2D^®-Gelen mit Coomassie-Brilliant-Blue-Stain (CBB) gefärbt. Eine separate Probe wurde auf unserem Auto2D®-Gerät analysiert und mittels halbtrockenem Blotting auf eine Immobilon^®-P-Blotting-Membran übertragen. Zur Immundetektion wurde die Blotting-Membran mit 5 % NFDM in PBS-T blockiert. Nach der Blockierung wurde das Sojabohnen-Allergie-Patientenserum (International Bioscience, Inc.) 20-fach in Blockierungslösung verdünnt, der Membran zugegeben und unter sanftem Schütteln inkubiert. Nach dem Waschen mit PBS-T wurde die Membran mit HRP-konjugierten sekundären Antikörpern in Blocklösung verdünnt, gefolgt von einer Standard-Chemilumineszenz-Detektion. 

Abbildung 5. 2D-E-Trennung von Sojabohnenextrakt und Immundetektion mit Patientenserum. Die Separation des Sojabohnenproteinextrakts erfolgte durch SDS-PAGE (A: 15 μg) und das Auto2D^®-System (B, C: 30 μg) mit IEF-Chip: PH3-10NL, PAGE-Chip: 12,5 % und das Tris-Glycin-Reagenz-Kit. Das Ganzprotein im Gel wurde mit CBB (A-1, B) gefärbt. Die Immundetektion wurde mit Sojabohnen-allergischem Patientenserum (A-2, C) durchgeführt. Entsprechend der Hauptbande in SDS-PAGE, wurden Spots, die als Gly m 6, ein Hauptbestandteil des Sojabohnenallergens, erachtet wurden, ungefähr bei 18 kDa nachgewiesen (rote Pfeile).

Jede zusätzliche Antigenprobe wurde unter den folgenden Bedingungen vorbereitet. Buchweizenmehl wurde mit Diethylether entfettet, mit Kokapuffer (85 mm NaCl, 32,7 mm NaHCO₃, 42,5 mm Phenol) behandelt und mit PBS dialysiert. Um Salze und ionische Verunreinigungen zu entfernen, die den Erst-D-IEF-Prozess beeinflussen können, wurde das Buchweizenextrakt mit einem Proteinfällungs-Kit (ProteoExtract^®-Kit) weiterverarbeitet. Walnüsse wurden mit einem Mörser zerkleinert, und die Proteinextraktion wurde mit dem Säugetierzellen-Lyse-Kit (MCL1, Sigma) durchgeführt. Lachsrogen-Gewebe wurde in 1M KCl-PBS homogenisiert. Walnuss- und Lachsrogen-Extrakte wurden mit Hilfe von Spin-Säulen zur Gelfiltration entsalzt. Je nach Entsalzungsmethode wurden Proteinproben in Rehydrationslösung (8M Harnstoff, 2M Thioharnstoff, 4 % CHAPS, 50 mm DTT, 0,02 % Ampholyt) gelöst oder in Rehydrationslösung ausgetauscht.

Die Proteinquantifizierung für jede vorbereitete Probe wurde mittels BCA- oder Bradford-Protein-Assay durchgeführt. Die Proteintrennung wurde mit dem vorinstallierten Standardprogramm Auto2D^® („PH3-10NL M“-Rezept) oder mit einer herkömmlichen SDS-PAGE durchgeführt. IEF-Chip PH3-10NL und PAGE-Chip 12,5 % wurden als Erst-D- und Zweit-D-Gelchip gewählt, um einen größtmöglichen Trennbereich abzudecken. Nach der Elektrophorese wurden in Auto2D^®-Gelen getrennte Proteine mit Coomassie-ReadyBlue™-Färbung oder SYPRO^®-Ruby-Gel-Färbung gefärbt. Separat vorbereitete Auto2D^®-Gele für die Immundetektion wurden vom Chip entfernt und mit einem Nasstransfergerät (KS8452, Oriental Instrument) auf eine Immobilon®-P Blotting-Membran übertragen. Die PVDF-Membranen mit übertragenen Proteinen wurden 1 Stunde lang mit dem SuperBlock™ Blocking-Puffer in PBS blockiert. Die Sera der Patienten wurden mit PBS mit 0,1 % BRIJ 30-fach verdünnt und konnten auf einem Schüttler bei 4 °C über Nacht mit den Membranen reagieren. Nach dem Waschen der Membran mit dem oben genannten Verdünnungspuffer wurde alkalische-Phosphatase (AP)-konjugiertes Anti-Human-IgE-Ab (SeraCare), 2.000-fach verdünnt, als sekundärer Ab aufgetragen und 3 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Waschen wurde die Membran in AP-Reaktionspuffer äquilibriert (100 mM Tris-HCl-Puffer pH 9,5 mit 100 mM NaCl und 5 mM MgCl₂) und reagierte mit einem 1-Komponenten-BCIP/NBT-Substrat (SeraCare) für den chromogenen Nachweis der Zielproteine.

Abbildung 6. 2D-E-Trennung von Walnussproteinextrakt und Immundetektion mit allergischem Patientenserum. Walnussproteinextrakt wurde in einer Spin-Säule mit Gelfiltration entsalzt und mit Rehydrationslösung äquilibriert. Die Trennung erfolgte durch SDS-PAGE (A) und Auto2D^®-System (B, C, D: 10 μg) mit IEF-Chip: PH3-10NL, PAGE-Chip: 12,5 % und Tris-Glycin-Reagenz-Kit. Das Ganzprotein im Walnussextrakt wird mit Amidoschwarz auf Membran (A) und mit SYPRO^® Ruby-Gel-Färbung (B) visualisiert, die Immundetektion erfolgte anhand von Patientenserum (C) und nichtallergischem Serum als Negativkontrolle (D).

Abbildung 7. Immundetektion mit Buchweizen-allergischem Patientenserum. Mit dem ProteoExtract^® Fällungskit behandelter Buchweizenproteinextrakt wurde in Rehydrationslösung gelöst. Die Trennung erfolgte durch SDS-PAGE (A) und Auto2D^®-System (B, C, D: 10 μg) mit IEF-Chip: PH3-10NL, PAGE-Chip: 12,5 % und das Tris-Glycin-Reagenz-Kit. Vollprotein in Buchweizenextrakt wird mit Amidoschwarz auf Membran (A-1) oder SYPRO^®-Ruby-Reagenz in Gel (B) visualisiert. Immundetektion mit Patientenserum (A-2 und C) und nichtallergischem Serum als Negativkontrolle (A-3 und D).

Abbildung 8. Trennung und Immundetektion allergischer Komponenten durch Sondierung mit Lachsrogen-allergischem Patientenserum. Lachsrogen-Proteinextrakt wurde in einer Gelfiltrations-Spin-Säule entsalzt und mit Rehydrierungslösung äquilibriert. Die Trennung erfolgte durch SDS-PAGE (A) und das Auto2D^®-System (B, C, D) mit IEF-Chip: PH3-10NL, PAGE-Chip: 12,5 % und das Tris-Glycin-Reagenz-Kit. Das Ganzprotein in Lachsrogen-Extrakt wird durch Amidoschwarz auf Membran (A-1) oder ReadyBlueTM CBB-Färbereagenz in Gel (B, 35 μg) visualisiert. Immundetektion mit Patientenserum (A-2 und C, 10 μg) und nichtallergischem Serum als Negativkontrolle (A-3 und D: 10 μg). Flecken (rote Pfeile) um 15 bis 20 kDa gelten als Hauptallergene der Lachsrogen-β-Komponente, die ein 35 kDa-Vitellogenin-Fragment ist, das aus zwei Untereinheiten besteht.

Die Western-Blot-Bilder wurden mit dem Ganzprotein-Nachweis verglichen, um die Protein-Spots zu identifizieren, die mit IgE in allergischen Seren reagiert hatten. Um die allergene Komponente zu identifizieren, werden gewöhnlich überlappende Spots aus dem Gel entfernt, enzymatisch im Gel zu Peptidfragmenten verdaut und die Fragmente mittels Massenspektralanalyse analysiert.   2D-E konnte eine überlegene Auflösung nachweisen und zeigte das Vorhandensein mehrerer Proteine in einer anscheinend einzigen Bande in 1D-E. Diese Daten deuten darauf hin, dass IgE-reagierende Proteine durch 2D-Immundetektion mit allergischen Seren in weniger Schritten getrennt und identifiziert werden können, was die Identifizierung verursachender Moleküle durch Massenspektralanalyse vereinfacht.

Auto2d^® 2-D für Lebensmittelallergieanwendungen

Die zweidimensionale Gelelektrophorese ist ein gängiges Verfahren zur Proteintrennung, das zum Nachweis und zur Identifizierung allergener Proteine verwendet wird. Das Auto2D^®-System wurde entwickelt, um den Zeitaufwand und das technische Fachwissen zu reduzieren, die erforderlich sind, um mit dieser Technik hochwertige Ergebnisse zu erzielen. Hier bestätigen wir den Nutzen des Auto2D^®-Systems für die Allergieforschung aufgrund des Nachweises von Allergenen in Proteinproben aus vier Nahrungsquellen. Darüber hinaus konnten wir ein bekanntes, wichtiges Allergen in jeder der Soja- und Lachsrogen-Proben aus einer einzigen Bande in eindimensionaler SDS-PAGE mithilfe des Auto2D^®-Systems in mehrere unterschiedliche Spots auflösen. In der Sojabohnenprobe wurden drei Spots aus der 18-kDa-Bande aufgelöst, die der Grunduntereinheit von Gly m 6 (Glycinin), einem wichtigen, bekannten allergenen Protein 9, entspricht. In der Lachsrogen-Probe wurden mehrere Spots aus der 16-18 kDa-Bande aufgelöst, die den beiden Untereinheiten der β-Komponente (Vitellogenin), ebenfalls einem wichtigen, bekannten allergenen Protein 10, entspricht. Insgesamt deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass das Auto2D^®-System effektiv als schnelle, zuverlässige Alternative zur herkömmlichen 2D-Gelelektrophorese für die Allergen-Immundetektion eingesetzt werden kann.

Danksagung:

Wir danken Prof. Tatsuya Moriyama (Universität Kindai, Fakultät für Landwirtschaft) für die Bereitstellung von Sojabohnendaten und Prof. Yasuto Kondo (Fujita Health University Bantane Hospital) für die Bereitstellung von Daten zu Walnüssen, Buchweizen und Lachsrogen.

Messung von HCP-Rückständen in Biopharmazeutika

Die 2-D-Gelelektrophorese eignet sich auch für die Analyse kontaminierender Wirtszellproteine (HCP) im Bioprozess therapeutischer Proteine und Antikörper. Rückstände von HCP-Verunreinigungen, die bei der Herstellung von Biologika eingebracht werden, können bei Patienten immunogene Reaktionen auslösen und die Potenz des Wirkstoffs verringern. Die Einhaltung gesetzlicher Vorschriften erfordert die Überwachung und Entfernung von HCP auf ein annehmbar niedriges Niveau, um die Sicherheit zu gewährleisten. In den Pharmakopöen in Japan, Europa und den Vereinigten Staaten wurden Richtlinien für die Entwicklung und Validierung von HCP-Assays für die Herstellung biopharmazeutischer Produkte veröffentlicht.

Um die Anforderungen zu erfüllen, müssen HCP-Assays methodisch entwickelt und alle Assaykomponenten streng qualifiziert werden. Für die Antikörpervalidierung ist eine zweidimensionale Polyacrylamid-Gelelektrophorese (2D-PAGE) erforderlich, damit eine umfassende HCP-Abdeckung sichergestellt wird. Gelelektrophorese-Methoden, einschließlich 2D-PAGE, werden auch für die Charakterisierung von Antigenen empfohlen, die als Kalibrierstandards oder Immunogene für die Herstellung polyklonaler Antikörper verwendet werden. Durch das Auto2D^® 2-D-Elektrophoresesystem wird eine fortgeschrittene Anwenderschulung überflüssig, die Implementierung in Bioprozess-Workflows vereinfacht und die Einhaltung von Industriestandards sichergestellt.

Auto2D^® Systeme zur Validierung von Anti-HCP-Antikörpern für ELISA und andere Immunassays

ELISA ist das in der HCP-Analyse am häufigsten vorkommende Assayformat. Dieses Immunassay-Verfahren beruht auf polyklonalen Antikörpern, die HCP-Rückstände erkennen und ein breites Spektrum abdecken. In der japanischen und europäische Pharmakopöe wird die Verwendung einer 2-D-Gelelektrophorese mit anschließender Western-Blot-Analyse (2-D-Western-Blotting) spezifiziert, um die HCP-Antikörperabdeckung zu bewerten. In der U.S. Pharmakopöe wird die Verwendung von 2-D Western Blotting oder Immunaffinitätsreinigung mit anschließender Gelelektrophorese zur Bewertung der Antikörperabdeckung spezifiziert.

Abbildung 9. 20 μg Cy3-markiertes CHO HCP-Antigen aus einer kommerziellen Quelle wurde durch 2-D-Gelelektrophorese auf dem Auto2D^® System mit einem IEF-Chip pH 3-10 und einem PAGE-Chip 12,5 % getrennt (A). Die Proteine wurden dann auf Membranen übertragen und durch Western Blotting mit zwei verschiedenen Anti-HCP-Antikörpern analysiert (B, C). Die Daten deuten darauf hin, dass der Anti-HCP-Antikörper 1 im Vergleich zum Anti-HCP-Antikörper 2 eine breitere Abdeckung von Wirtszellproteinen aufweist.

Hohe Reproduzierbarkeit des Auto2D^® Systems

Konsistente, reproduzierbare Prozesse sind bei der Herstellung und Qualitätskontrolle von Biologika unerlässlich. Das vollautomatische Auto2D^® Gelelektrophorese-System liefert nicht nur schneller Ergebnisse und bietet einen höheren Durchsatz, sondern eliminiert auch Schwankungen zwischen Tagen und Anwendern bei 2D-PAGE- und 2D-DIGE-Verfahren und bietet eine deutlich bessere Reproduzierbarkeit für zuverlässigere Ergebnisse.

Abbildung 10. 0.75 μg Cy5-markiertes CHO HCP-Antigen aus einer kommerziellen Quelle wurde durch 2D-Gelelektrophorese getrennt und auf dem Auto2D^® System mit einem IEF-Chip pH 3-10NL und einem PAGE-Chip 12,5 % analysiert. Die gleiche Probe wurde insgesamt dreimal gemessen (A-C). Weiße Punkte (D) zeigen Überschneidungen der Ergebnisse auf. Die Daten lassen auf eine hohe Reproduzierbarkeit der zweidimensionalen Gelelektrophorese mit dem Auto2D^® System schließen.

Auto2D^® System für die Antigen-Profilerstellung

Die Immunisierung mit HCP-Antigen ist erforderlich, um polyklonale Antikörperpools für ELISA und andere Immunassays zu erhalten. HCP-Antigen wird auch als Kalibrierstandard für den Nachweis und die Quantifizierung verwendet. Prozessspezifische HCP-Antigene werden mit nicht-transfizierten Nullzellkulturen erzeugt. Diese Antigene müssen charakterisiert werden, um das Muster der HCP aufzuzeigen, das Vorhandensein eines breiten Proteinspektrums zu bestätigen und nachzuweisen, dass HCP-Antigene aus Nullkulturen repräsentativ für HCP-Antigene in Produktionskulturen sind. Die japanischen, europäischen und US-amerikanischen Pharmakopöen empfehlen die Verwendung von SDS-PAGE oder 2-D-Gelelektrophorese zur Antigencharakterisierung und -profilerstellung. In der U.S. Pharmakopöe wird darüber hinaus die Verwendung der 2-D-Gelelektrophorese als Komplementationsverfahren zur Überwachung von HCP-Rückständen empfohlen.

Abbildung 11. Ein Gemisch aus Cy3-markiertem nicht aufgereinigtem CHO HCP-Antigen und Cy5-markiertem Protein A-aufgereinigtem CHO HCP-Antigen wurde mittels zweidimensionaler Differenz-Gelelektrophorese (2D-DIGE) unter Einsatz des Auto2D^® Systems getrennt und analysiert (A-B). Rote Flecken in den zusammengeführten Daten (C) stellen Wirtszellproteine dar, die auch nach der Aufreinigung von Protein A in der Regel erhalten bleiben. Diese Daten belegen die Verwendung des Auto2D^® Systems für die Erstellung von Profilen der verbleibenden Wirtszellproteinkomponenten nach der Aufreinigung.

Auto2D^® System zur Einhaltung gesetzlicher Vorschriften

Das Auto2D^® System unterstützt Sie bei der Einhaltung gesetzlicher Vorschriften in Bezug auf die HCP-Analyse in der biopharmazeutischen Produktion. Durch dieses vollautomatische System werden Schwankungen zwischen Tagen und Anwendern eliminiert und zuverlässige Ergebnisse in weniger als 2 Stunden geliefert. Das Auto2D^® System lässt sich leicht in Bioprozess-Workflows implementieren und reduziert mit Produktionsänderungen verbundene Ausfallzeiten im Labor. Ein Outsourcing ist nicht erforderlich – schützen Sie Ihr geistiges Eigentum mit Inhouse-Ressourcen für HCP-Analysen. Weitere Produkte und Ressourcen finden Sie auf unserer Hub-Seite über Protein-Elektrophorese und Western Blotting.

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