Bestimmung der Phospholipid-Oxidation durch UV/VIS-Spektroskopie - Avanti^® Polar Lipids

Definition

Die prozentuale Oxidation eines Phospholipids kann mit Hilfe des Beerschen Gesetzes bestimmt werden, indem die Konzentration des peroxidierten Phospholipids aus seiner Extinktion bei 234 nm berechnet wird.

Anwendungsbereich

Gilt für alle ungesättigten Phospholipide.

Apparatur

• UV/VIS-Spektralphotometer
• HELLMA UV-Quarz-Probenküvette (QS 1.000)
• Kimwipes
• Einweg-Glasröhrchen

Reagenzien

• Ethanol (200 Proof, dehydriert USP)
• Entionisiertes Wasser
• 16:0 PC (DPPC)

Durchführung

1. Die DPPC-Probe vorbereiten. Mindestens 3 ml einer 1 mg/ml-Lösung DPPC gelöst in Ethanol/VE-Wasser (9:1) vorbereiten.
2. Die Probe vorbereiten. Mindestens 3 ml einer 1 mg/ml-Lösung der in Ethanol/DI-Wasser (9:1) gelösten Phospholipidprobe vorbereiten.
3. Die Blindprobe durchführen. Die Blindprobe (Hintergrund) ist das Lösungsmittel, das zum Lösen der Phospholipidproben verwendet wurde.
   • Die Probenküvette dreimal mit dem Lösungsmittel spülen, um alle restlichen Verunreinigungen aus der Küvette zu entfernen.
   • 3/4 der Probenküvette mit der Referenz füllen.
   • Ein Kimwipe verwenden, um alle Fingerabdrücke und Verunreinigungen von der Außenseite der Probenküvette abzuwischen.
   • Die Probenküvette in das Spektralphotometer einsetzen und ein Blindprobenspektrum erstellen.
4. Die DPPC-Probe durchführen.
   • Das Blindprobenlösungsmittel aus der Probenküvette ausgießen.
   • 3/4 der Probenküvette mit der DPPC-Probenlösung auffüllen.
   • Fingerabdrücke von der Außenseite der Probenküvette entfernen.
   • Die Probenküvette in das Spektralphotometer einsetzen und ein DPPC-Spektrum durchlaufen lassen.
5. Die Probe durchlaufen lassen.
   • Die DPPC-Probe aus der Probenküvette ausgießen.
   • Die Probenküvette dreimal mit dem Lösungsmittel spülen, um alle DPPC-Reste aus der Küvette zu entfernen.
   • 3/4 der Probenküvette mit der Phospholipidprobe auffüllen.
   • Fingerabdrücke von der Außenseite der Probenküvette entfernen. Die Probenküvette in das Spektralphotometer einsetzen und ein Probenspektrum ausführen.
   • Das DPPC-Spektrum vom Probenspektrum subtrahieren und den Extinktionswert (OD) der Phospholipidprobe bei 234 nm aufzeichnen.

Berechnungen

Konzentration des peroxidierten Lipids (D) = A/(B*C)
A = Extinktionswert (OD) bei 234 nm
B = Extinktionskoeffizient in (OD*ml)/(mmol*cm) (27.000 für peroxidiertes Lipid)
C = Weglänge in cm
Prozentuale Oxidation = D/E * 100
D = Konzentration des peroxidierten Lipids in mg/ml
E = Konzentration der Lipidprobe = 1,0 mg/ml

Literatur

1. Kim R, LaBella F. 1987. Comparison of analytical methods for monitoring autoxidation profiles of authentic lipids. J. Lipid Res. 28:1110-1117.