pGEX-Vektoren
GST-markierte Proteine werden durch Einfügen eines Gens oder Genfragments in die MCS eines der 13 pGEX-Vektoren hergestellt. Die Expression erfolgt unter Kontrolle des tac-Promoters, der durch das Lactoseanalogon Isopropyl-β-D-thiogalactosid (IPTG) induziert wird. Alle pGEX-Vektoren sind außerdem mit einem internen lacIq-Gen ausgestattet. Das lacIq-Genprodukt ist ein Repressorprotein, das sich an die Operatorregion des tac-Promoters bindet und die Expression bis zur Induktion durch IPTG verhindert, wodurch die Expression des Inserts streng kontrolliert wird.
Neun der Vektoren verfügen über eine erweiterte MCS, die sechs Restriktionsstellen enthält. Die erweiterte MCS erleichtert die unidirektionale Klonierung von cDNA-Inserts, die aus Bibliotheken stammen, die mit vielen verfügbaren Lambda-Vektoren konstruiert wurden. Durch pGEX-6P-1, pGEX-6P-2 und pGEX-6P-3 wird jeweils die Erkennungssequenz für die ortsspezifische Spaltung durch die PreScission-Protease zwischen der GST-Domäne und der MCS codiert. pGEX-4T-1, pGEX-4T-2 und pGEX-4T-3 sind von pGEX-2T abgeleitet und enthalten eine Thrombin-Erkennungsstelle. pGEX-5X-1, pGEX-5X-2 und pGEX-5X-3 sind Derivate von pGEX-3X und verfügen über eine Faktor-Xa-Erkennungsstelle (Tabelle 1.1).
pGEX-2TK hat ein anderes MCS als die anderen Vektoren. pGEX-2TK wurde entwickelt, um den Nachweis von exprimierten Proteinen durch direkte Markierung der markierten Produkte in vitro zu ermöglichen. Dieser Vektor enthält die Erkennungssequenz für die katalytische Untereinheit der cAMP-abhängigen Proteinkinase aus dem Herzmuskel. Die Proteinkinasestelle befindet sich zwischen der Thrombin-Erkennungsstelle und der MCS. Die exprimierten Proteine können mit Proteinkinase und [γ-32P]ATP direkt markiert und leicht mit Standard-Radiometrie- oder Autoradiographie-Techniken nachgewiesen werden. pGEX-2TK ist ein Derivat von pGEX-2T und das markierte Protein kann mit Thrombin gespalten werden.
Zusammengenommen bieten die pGEX-Vektoren alle drei translationale Leserahmen, beginnend mit der EcoRI-Restriktionsstelle (Abbildung 1.1). pGEX-1λT, pGEX-6P-1, pGEX-4T-1 und pGEX-5X-1 können cDNA-Inserts, die aus λgt11-Bibliotheken isoliert wurden, direkt aufnehmen und exprimieren.
Eine Liste der Kontrollregionen der pGEX-Vektoren ist in Anhang 2 (Kontrollregionen für pGEX-Vektoren) enthalten. Vollständige DNA-Sequenzen und Daten zu Restriktionsstellen stehen in der GenBank™ zur Verfügung. Die GenBank-Hinterlegungsnummern sind in Anhang 2 (Kontrollregionen für pGEX-Vektoren) aufgeführt.
Abbildung 1.1.Karte der GST-Vektoren mit Darstellung der Leserahmen und Hauptmerkmale. Alle 13 Vektoren verfügen downstream von der MCS über Stoppcodons in allen drei Leserahmen (in dieser Karte nicht dargestellt). In Anhang 2 (Kontrollregionen für pGEX-Vektoren) sind die Kontrollregionen der 13 Vektoren aufgeführt.
Den richtigen Vektor auswählen, der zum Leserahmen des klonierten Inserts passt.
Überlegen, welche Protease und welche Bedingungen für die Spaltung der Zielproteinaufbereitung am besten geeignet sind.
pGEX-6P PreScission Proteasevektoren bieten die effizienteste Methode für die Spaltung und Aufreinigung von GST-markierten Proteinen. Die ortsspezifische Spaltung erfolgt bei gleichzeitiger Immobilisierung der Protease auf der Säule. Die Protease verfügt über eine hohe Aktivität bei niedrigen Temperaturen, sodass alle Schritte im Kühlraum durchgeführt werden können, um die Integrität des Zielproteins zu schützen. Spaltungsenzym und GST-Tag werden in einem einzelnen Schritt entfernt.
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