Probenaufreinigung
Es können verschiedene chemische und physikalische Aufreinigungsmethoden angewendet werden, um einen Zielanalyten vor der Analyse zu trennen oder aufzukonzentrieren. Dazu gehören u.a. Absorption, Adsorption, Chromatographie, Destillation, Extraktion, Ionenaustausch, Filtration, Komplexbildung, Kristallisation, Trocknung und viele mehr. Die Probenvorbereitung vor der Analyse dient dazu, die Probe in ein Format zu bringen, das mit der Analysetechnik kompatibel ist, die Komplexität der Probe zu reduzieren, interferierende Verunreinigungen zu entfernen und den Analyten vor der Analyse aufzukonzentrieren. Eine geeignete Probenvorbereitung verhindert Verstopfungen, kann die Notwendigkeit strenger Waschverfahren reduzieren und die Lebensdauer des chromatographischen Mediums verlängern.
Zugehörige technische Artikel
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Zugehörige Protokolle
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Einige der folgenden, häufig eingesetzten Aufreinigungstechniken werden im Labor verwendet, um Proben für die nachgeschaltete Analyse vorzubereiten.
Dialyse
Die Dialyse ist eine Aufreinigungstechnik, die zur Entfernung von Salz oder anderen Molekülen mit niedrigem Molekulargewicht aus einer Probe verwendet wird. Sie wird auch verwendet, um die Pufferzusammensetzung einer Probe auszutauschen. Die Dialyse ist ein passives Verfahren, für das große Puffermengen benötigt werden.
Pufferaustausch & Entsalzung
Die Entsalzung ist eine einfache Methode zur Entfernung von Salzen und anderen niedermolekularen Verunreinigungen aus einer Probe. Sie wird auch für den Pufferaustausch vor oder nach verschiedenen chromatographischen Schritten und für die schnelle Entfernung von Reagenzien zum Beenden einer Reaktion verwendet.
Fraktionierte Fällung
Die fraktionierte Fällung wird verwendet, um grobe Verunreinigungen aus kleinen Probenmengen zu entfernen. In Fällungstechniken werden Fraktionen anhand der unterschiedlichen Löslichkeit getrennt. Da sich Proteine in ihrem Grad der Hydrophobie unterscheiden, können erhöhte Salzkonzentrationen die hydrophoben Wechselwirkungen zwischen den Proteinen verstärken und Ausfällungen verursachen.
Extraktion
Die Probenvorbereitung durch Extraktion umfasst die Isolierung von Zielanalyten aus einer komplexen Probe oder einem sehr viel größeren Probenvolumen. In diesem Prozess werden interferierende Probenbestandteile entfernt, die HPLC- und GC-Säulen blockieren können. Außerdem wird die Analytenkonzentration um einen Faktor zwischen 100 und 5000 erhöht, wodurch die Nachweisempfindlichkeit erheblich verbessert wird. Als Teil einer selektiven und spezifischen Probenvorbereitung ermöglicht die Extraktion eine zuverlässigere chromatographische Analyse. Zu den Extraktionsarten gehören die Flüssig-Flüssig-Extraktion, die Festphasenextraktion (SPE) und die Festphasenmikroextraktion (SPME).
Affinitätschromatographie
In der Affinitätschromatographie werden Proteine auf Basis reversibler Wechselwirkungen zwischen einem Protein und einem spezifischen Liganden, der an eine Chromatographiematrix gekoppelt wurde, getrennt. Die Technik ist hochselektiv und ermöglicht eine Proteinaufreinigung mit hoher Kapazität. Die Affinitätschromatographie kann immer dann eingesetzt werden, wenn ein geeigneter Ligand für das Zielprotein verfügbar ist.
Die Aufreinigung durch Affinitätschromatographie umfasst Bindungs- und Elutionsschritte. In der Bindungsphase wird das Zielprotein spezifisch und reversibel an einen komplementären Liganden gebunden, der auf einer Chromatographiematrix immobilisiert wurde. Ziel ist es, das Zielprodukt unter Erhalt der Wirksamkeit und Aktivität zu isolieren, aufzukonzentrieren und zu stabilisieren. Nach dem Waschen der Matrix zur Entfernung ungebundenen Materials wird das gebundene Zielprotein zurückgewonnen, indem die Bedingungen so verändert werden, dass die Elution begünstigt wird. Die Elution erfolgt spezifisch mit einem kompetitiven Liganden oder unspezifisch durch Änderung des pH-Werts, der Ionenstärke oder der Polarität. Durch die Elution kann das Zielprotein in einer gereinigten und aufkonzentrierten Form gesammelt werden.
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