Saggi di proliferazione e vitalità cellulare
- Saggi di proliferazione basati sulla sintesi del DNA
- Saggi di proliferazione basati sull’attività metabolica
- Saggi di vitalità cellulare in luminescenza
- Saggi di proliferazione con coloranti fluorescenti
- Colture cellulari 3D - Tripla colorazione di cellule vive/morte/totali
- Conteggio delle cellule con trypan blue
Introduzione
I saggi per misurare la proliferazione e la vitalità cellulare e la citotossicità si usano comunemente per monitorare la risposta e la salute delle cellule in coltura dopo trattamento con diversi stimoli. La scelta del metodo di analisi adatto dipende dal numero e dal tipo di cellule in esame, nonché dal tipo di risultato atteso. Per analizzare la proliferazione cellulare è possibile monitorare la variazione del numero di cellule nel tempo, il numero di divisioni cellulari, l'attività metabolica oppure la sintesi del DNA. Il conteggio delle cellule basato su coloranti di vitalità come il trypan blue o la calceina-AM fornisce sia il tasso di proliferazione che la percentuale di cellule vitali.
Panoramica sui saggi di proliferazione e vitalità cellulare
Saggi di proliferazione basati sulla sintesi del DNA
Saggio di proliferazione cellulare con BrdU
La proliferazione cellulare si può studiare monitorando l’incorporazione di un radioisotopo, la [3H]-timidina, nel DNA cellulare seguita da autoradiografia. Invece della timidina, si può optare per la 5-bromo-2’-deossiuridina (BrdU). Le cellule che hanno incorporato BrdU nel loro DNA sono facilmente identificabili tramite un anticorpo monoclonale contro la BrdU e un anticorpo secondario coniugato a un enzima o a un fluorocromo.
Figura 1.A. Cellule proliferanti in occhio di embrione di pollo al giorno E4 evidenziate mediante marcatura con BrdU. B. Validazione dell’anticorpo anti-BrdU mediante camptotecina. Trattando le cellule Jurkat con la camptotecina, un agente che arresta il ciclo cellulare, le cellule che stanno ciclando si bloccano nella transizione tra le fasi G1/S.
Saggio EdU di proliferazione cellulare
Il saggio EdU Baseclick per la valutazione della proliferazione cellulare è un metodo efficiente per la rivelazione della fluorescenza emessa dal DNA in replicazione. Il nucleoside modificato EdU viene aggiunto alle cellule vitali e viene incorporato nel DNA in fase di replicazione. La “Click Chemistry” indotta da Cu permette il legame rapido di EdU a sonde fluorescenti. Ciò permette di monitorare in modo quantitativo le cellule proliferanti. Questo tipo di saggio è disponibile in svariati formati adatti per microscopia, citometria a flusso, screening ad alto rendimento ed esperimenti in vivo. Si possono utilizzare quattro diverse sonde fluorescenti, con picco di eccitazione a 488, 555, 594, e 647 nm, per effettuare analisi multiplex con altre sonde fluorescenti.
Figura 2.Con il kit Edu-Click si ha l’incorporazione di EdU (5-etinil-2’-deossiuridina) nel DNA quando questo viene sintetizzato attivamente, con quantificazione della fluorescenza mediante un metodo basato sulla “Click Chemistry”.
Saggi di proliferazione basati sull’attività metabolica
I saggi che misurano l'attività metabolica sono indicati per analizzare la proliferazione e la vitalità cellulare e la citotossicità. La riduzione dei sali di tetrazolio come MTT, XTT e WST-1 a composti formazano colorati o la bioriduzione di resazurina avviene solo nelle cellule metabolicamente attive. Nelle cellule attivamente proliferanti si osserva un aumento dell’attività metabolica, mentre in quelle esposte a tossine tale attività risulta ridotta.
Saggio di proliferazione cellulare con MTT
L’MTT (3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5- difeniltetrazolio bromuro; blu di tiazolile) è un sale di tetrazolio idrosolubile che conferisce una colorazione gialla quando presente in terreni o soluzioni saline prive di rosso fenolo. L’MTT dissolto è convertito in un formazano viola insolubile a seguito della scissione dell’anello tetrazolico da parte di deidrogenasi. Questo formazano insolubile in acqua può essere solubilizzato usando isopropanolo o altri solventi e il materiale dissolto si valuta spettrofotometricamente misurando l’assorbanza come funzione della concentrazione del colorante convertito.
Saggio di proliferazione cellulare con XTT
Diversamente dall’MTT, il prodotto di scissione dell’XTT è solubile in acqua; pertanto il passaggio della solubilizzazione qui non è necessario. Il sale tetrazolico dell’XTT viene scisso a formazano da un complesso meccanismo cellulare. Questa bioriduzione avviene solo nelle cellule vitali ed è correlata alla produzione di NAD(P)H attraverso la glicolisi. La quantità di colorante formazano prodotto è proporzionale al numero di cellule metabolicamente attive nella coltura.
Saggio di proliferazione cellulare con WST-1
Il sale tetrazolico WST-1 stabile viene scisso in un formazano solubile mediante un complesso meccanismo cellulare che avviene principalmente sulla superficie cellulare. Questa bioriduzione dipende principalmente dalla produzione di NAD(P)H da parte delle cellule vitali attraverso il processo di glicolisi. La quantità di colorante formazano prodotto è proporzionale al numero di cellule metabolicamente attive nella coltura.
Guida ai Protocolli: Saggio WST-1 per la valutazione della proliferazione e della vitalità cellulare. Protocolli, domande frequenti e risoluzione dei problemi
Figura 3.Il saggio MTT è un’analisi colorimetrica che permette di valutare la proliferazione cellulare misurando l’attività metabolica. Gli enzimi ossidoriduttasi NAD(P)H-dipendenti cellulari riflettono il numero di cellule vitali presenti. Questi enzimi sono in grado di ridurre il colorante tetrazolico giallo MTT, ossia bromuro di 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio, in un formazano insolubile di colore viola.
Saggi di vitalità cellulare in luminescenza
Dato che l’ATP è un indicatore delle cellule metabolicamente attive, è possibile misurare indirettamente il numero di cellule vitali in base alla quantità di ATP disponibile. Il saggio di vitalità cellulare basato sull’uso di ATP da parte di luciferasi è un saggio omogeneo altamente sensibile per quantificare l’ATP nelle colture cellulari. Il kit sfrutta la luciferasi di lucciola per ossidare la D-luciferina, con conseguente emissione di luce che è proporzionale alla quantità di ATP disponibile nella coltura cellulare. La sensibile procedura del saggio prevede la sola aggiunta del cocktail di rivelazione dell’ATP direttamente alle cellule coltivate in terreno supplementato con siero. Non è necessario lavare le cellule, rimuovere il terreno né pipettare ripetutamente. Il kit è caratterizzato da una sensibilità sufficiente per rilevare una singola cellula o 0,01 picomoli di ATP. Il segnale emesso è lineare entro sei ordini di grandezza. Correlando la quantità di ATP al numero di cellule vitali, il saggio trova applicazione in diversi campi, dalla determinazione del numero di cellule vitali alla proliferazione cellulare fino alla citotossicità.
Figura 4.Saggio di vitalità cellulare basato sull’uso di ATP da parte della luciferasi con emissione di bioluminescenza Uso di ATP da parte della luciferasi di lucciola per ossidare la D-luciferina e conseguente emissione di luce per valutare la quantità di ATP disponibile che è correlata al numero di cellule e alla vitalità cellulare.
Saggi di proliferazione con coloranti fluorescenti
Marcatura con CFSE
La 5(6)-carbossifluoresceina diacetato N-succinnimidil estere (CFSE) è comunemente usata per misurare il numero di divisioni cellulari avvenute in una data popolazione cellulare. Una volta entrata nella cellula, la CFSE viene scissa dalle esterasi intracellulari a formare un composto fluorescente, il cui gruppo succinimmidico si lega covalentemente ai gruppi amminici primari delle proteine intracellulari. In seguito alla divisione, l'intensità di fluorescenza è ripartita tra le due cellule figlie, il che consente di valutare il numero di divisioni cellulari mediante citometria a flusso. La CFSE è spesso usata per misurare la proliferazione dei linfociti, compresi i linfociti T.
Doppia colorazione di cellule vive/morte
Grazie alla doppia colorazione di cellule vive/morte si ottiene la rivelazione simultanea in fluorescenza delle cellule sia vive che morte. La calceina-AM è un colorante altamente lipofilo capace di attraversare la membrana cellulare. Sebbene la calceina-AM di per sé non sia una molecola fluorescente, in una cellula vitale la calceina generata dalle esterasi a partire dalla calceina-AM emette una forte fluorescenza verde (λex 490 nm, λem 515 nm). Pertanto la calceina-AM colora solo le cellule vitali, diversamente dal colorante dei nuclei, lo ioduro di propidio, che non attraversa la membrana di una cellula viva ma che, attraversando zone disorganizzate della membrana di cellule morte, raggiunge il nucleo dove si intercala nella doppia elica del DNA ed emette fluorescenza (λex 535 nm, λem 617 nm). Poiché sia la calceina che il PI-DNA sono eccitabili alla lunghezza d’onda di 490 nm, è possibile monitorare simultaneamente le cellule vive e quelle morte utilizzando un microscopio a fluorescenza dotato di un’unica lunghezza di eccitazione.
Figura 5.Doppia colorazione di cellule vive/morte
Colture cellulari 3D - Tripla colorazione di cellule vive/morte/totali
Il kit per l’imaging di cellule vitali è un saggio a tre colori utilizzabile su colture cellulari 2D e 3D per la colorazione simultanea in fluorescenza non solo delle cellule vive (calceina-AM) e di quelle morte (ioduro di propidio/DNA), ma anche della loro totalità (Hoechst 33342).
- La calceina-AM emette fluorescenza verde legandosi con il calcio, in seguito all’azione delle esterasi che avviene solo nelle cellule vitali e metabolicamente attive.
- Lo ioduro di propidio (PI) è un colorante nucleare che non attraversa la membrana integra delle cellule vive, ma solo quella danneggiata delle cellule morte, e che intercalandosi nel DNA emette una forte fluorescenza rossa.
- Il colorante del DNA Hoechst 33342, caratterizzato da una bassa citotossicità, emette una fluorescenza blu ed è un indicatore del numero totale di cellule.
Conteggio delle cellule con trypan blue
Il trypan blue è uno dei numerosi coloranti raccomandati per il conteggio delle cellule vive per esclusione. Infatti il metodo si basa sul principio che il colorante blu non entra nelle cellule vive (vitali) ma solo nelle cellule morte (non vitali). La vitalità cellulare si può quindi ottenere calcolando il rapporto tra il numero di cellule vive rispetto alla totalità delle cellule (sia vive che morte). Questa colorazione facilita inoltre la visualizzazione della morfologia generale delle cellule.
N.B.: l’affinità del trypan blue per le proteine del siero è maggiore di quella per le proteine cellulari. Se il sottofondo è troppo scuro per via della presenza di siero nella matrice, le cellule vanno pellettate e risospese in terreno senza siero o soluzione salina prima di contarle.
Bibliografia
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