Protocollo per PLA Duolink^® in fluorescenza

Questo protocollo permette di rivelare, visualizzare e quantificare mediante immunofluorescenza singole proteine, modificazioni di proteine e interazioni tra proteine in campioni di cellule o tessuto tramite i reagenti per il saggio di ligazione di prossimità (PLA) Duolink^®. Per familiarizzare con la tecnologia del PLA Duolink^®, scarica la nostra brochure, mentre per maggiori dettagli consulta la pagina Come ottimizzare il saggio di ligazione di prossimità Duolink^®. Per altri protocolli, consulta le pagine Protocollo per PLA Duolink^® con microscopia in campo chiaro e Guida per l’uso del Duolink^® PLA Probemaker. 

Materiali e apparecchiature
Protocollo per PLA Duolink^® in fluorescenza
Risultati
Risoluzione dei problemi
Bibliografia

Materiali e apparecchiature

Reagenti per PLA Duolink^®

Per le raccomandazioni specifiche sui prodotti, fai riferimento alla Guida alla selezione dei prodotti Duolink^® PLA. In breve, per effettuare un esperimento di PLA Duolink^® con rivelazione in fluorescenza, sono necessari i seguenti prodotti Duolink^® PLA:

1. Sonde Duolink^® PLA (una sonda PLUS e una sonda MINUS da specie diverse che corrispondano alle specie ospite dei tuoi anticorpi primari). Ogni kit include:
   1. PLA Probes (5x) (sonde per PLA) – PLUS e/o MINUS, a seconda del prodotto
   2. Blocking Solution (soluzione per il blocco) – Per bloccare il campione prima delle incubazioni con gli anticorpi
   3. Antibody Diluent (diluente per anticorpi) – Per diluire le sonde per PLA e, se serve, gli anticorpi primari
   N.B.: tutti i componenti del kit vanno conservati a 4 °C.

   N.B.: per generare sonde per PLA personalizzate, utilizzare i kit Duolink^® PLA Probemaker PLUS e/o Probemaker MINUS. Per maggiori informazioni, consulta la Probemaker Guide.

2. Duolink^® Fluorescent Detection Reagent (reagente per la rivelazione in fluorescenza) (a scelta tra verde, arancione, rosso e rosso lontano). Ogni kit include:
   1. Ligation Buffer (tampone per la ligazione) (5x) – da diluire per ottenere il tampone di ligazione 1x5x
   2. Ligase (ligasi) (1 U/μL) – da aggiungere per preparare la soluzione di ligazione
   3. Amplification stock (soluzione madre per l’amplificazione) (5x) – da diluire per ottenere il tampone di amplificazione 1x
   4. Polymerase (polimerasi) (10 U/μL) - da aggiungere per preparare la soluzione di amplificazione
   N.B.: tutti i componenti vanno conservati a -20 °C.
3. Wash Buffers, Fluorescence (Tamponi di lavaggio, fluorescenza) (A e B)
4. Duolink^® Mounting Media with DAPI (mezzo da usare sui vetrini, conservare a 2-8 °C) OPPURE Nuclear Stain and Anti-fade  (colorante nucleare e anti-decadimento, da usare nelle micropiastre, conservare a -20 °C)

Altri materiali

1. Anticorpi primari a scelta per rilevare le proteine di interesse. Devono essere stati prodotti in topo, coniglio o capra se si usano con le Sonde Duolink^® PLA.
2. Acqua a elevata purezza (filtrata sterilmente, Milli-Q^® o simili)
3. Campione (cellule o tessuto) su vetrino, già sottoposto alle fasi preliminari di fissazione, recupero dell’antigene e permeabilizzazione. Consultare la pagina Come ottimizzare il saggio di ligazione di prossimità Duolink^® per suggerimenti e raccomandazioni e per approfondimenti su:
   1. elaborazione del protocollo sperimentale e controlli
   2. scelta e ottimizzazione degli anticorpi primari
   3. lavorazione dei campioni

Apparecchiature

1. Microscopio in fluorescenza con filtri adatti, fotocamera e software per l’acquisizione delle immagini
2. Incubatore a 37 °C
3. Agitatore orbitale
4. Camera di umidificazione riscaldata o Microplate Heat Transfer Block (blocco per trasferire il calore a micropiastre)
5. Penna idrofobica per delimitare l’area di reazione
6. Blocco ghiacciato (per gli enzimi)
7. Vaschette per la colorazione
8. Pinzette
9. Pipette e puntali (da 1 μL a 1.000 μL)
10. Coprivetrini adatti alla microscopia in fluorescenza

Protocollo per PLA Duolink^® in fluorescenza

Il seguente protocollo si riferisce a un campione di 1 cm² su vetrino che, per essere coperto completamente, richiede 40 µL di soluzione. Adeguare il volume in base all’area della reazione e al numero di campioni. Tutte le incubazioni vanno eseguite in una camera di umidificazione. Tutti i lavaggi vanno eseguiti a temperatura ambiente in una vaschetta per la colorazione contenente almeno 70 mL di tampone e sotto leggera agitazione.

Preparazione dei reagenti

1. Prima di iniziare il saggio, preparare i Wash Buffer A e B dissolvendo il contenuto di una busta in acqua a elevata purezza per ottenere un volume finale di 1.000 mL. Le soluzioni si conservano a temperatura ambiente per brevi periodi (meno di due settimane) oppure a 4 °C per periodi più lunghi. N.B.: prima dell'uso, lasciar equilibrare le soluzioni a temperatura ambiente.
2. Prima di iniziare il saggio, preparare il Wash Buffer B 0,01x diluendo 1:100 il Wash Buffer B 1x in acqua a elevata purezza.
3. Molti dei reagenti Duolink^® PLA sono forniti in forma di soluzione madre concentrata da diluire subito prima dell’uso. I reagenti Duolink^® PLA diluiti non vanno conservati.

Protocollo per PLA Duolink^®

Prima di iniziare, adagiare i campioni sui vetrini e sottoporli alle fasi preliminari di fissazione, recupero dell’antigene e permeabilizzazione. Per informazioni particolareggiate, consultare la pagina Come ottimizzare il saggio di ligazione di prossimità Duolink^®.

1. Blocco
   1. Vortexare la Duolink^® Blocking Solution.
   2. Aggiungere 1 goccia (~40 µL) di Duolink^® Blocking Solution a ogni campione di area pari a 1 cm². Accertarsi che tutto il campione sia coperto dalla Blocking Solution.
   3. In una camera di umidificazione preriscaldata, incubare i vetrini a 37 °C per 60 minuti.
2. Incubazione con l’anticorpo primario N.B.: non lasciar essiccare il vetrino prima di aggiungere l’anticorpo perché ciò potrebbe aumentare l’intensità del sottofondo.
   1. Vortexare il Duolink^® Antibody Diluent.
   2. Diluire l’anticorpo primario (o gli anticorpi primari) alla concentrazione appropriata utilizzando il Duolink^® Antibody Diluent.
   3. Rimuovere la Duolink^® Blocking Solution picchiettando i vetrini.
   4. Aggiungere la soluzione di anticorpo primario a ogni campione.
   5. Incubare i vetrini in una camera di umidificazione. Attenersi alla temperatura e ai tempi di incubazione ottimali per l’anticorpo in uso.
3. Incubazione con le sonde Duolink^® PLA Probe
   
   1. Vortexare le sonde per PLA PLUS e MINUS.
   2. Diluire 1:5 le sonde per PLA PLUS e MINUS nel Duolink^® Antibody Diluent.
      Per ottenere un volume di reazione di 40 µL, prelevare 8 µL dalla soluzione stock della sonda per PLA MINUS, 8 µL dalla soluzione stock della sonda per PLA PLUS e 24 µL di Antibody Diluent. Preparare una quantità di soluzione sufficiente per tutti i campioni.
   3. Rimuovere la soluzione con gli anticorpi primari picchiettando i vetrini
   4. Effettuare 2 lavaggi lasciando ogni volta i vetrini per 5 minuti in Wash Buffer A 1x a temperatura ambiente.
   5. Eliminare l’eccesso di Wash buffer picchiettando i vetrini e applicare la soluzione con le sonde per PLA.
   6. In una camera di umidificazione preriscaldata, incubare i vetrini a 37 °C per 1 ora.
4. Ligazione
   N.B.: la ligasi va aggiunta al tampone di ligazione subito prima che entri in contatto con il campione. Accertarsi che il Ligation Buffer sia completamente scongelato e ben miscelato prima di usarlo.
   1. Diluire 1:5 il Duolink^® Ligation Buffer 5x in acqua a elevata purezza e miscelare.
      Per ottenere 40 µL di tampone di ligazione 1x, aggiungere 8 µL del Ligation buffer 5x a 32 µL di acqua a elevata purezza. Preparare una quantità di soluzione sufficiente per tutti i campioni.
   2. Rimuovere la soluzione con le sonde per PLA picchiettando i vetrini.
   3. Effettuare 2 lavaggi lasciando ogni volta i vetrini per 5 minuti in Wash Buffer A 1x a temperatura ambiente.
   4.  Durante i lavaggi, prelevare la ligasi dal congelatore e riporla su un blocco congelante (-20 °C).
   5. Diluire 1:40 la ligasi nel tampone di ligazione 1x ottenuto al passaggio (a) e miscelare.
      Per ottenere 40 µL di soluzione di ligazione, aggiungere 1 µL di ligasi a 39 µL di tampone di ligazione 1x.
   6. Eliminare l’eccesso di Wash buffer picchiettando i vetrini e applicare la soluzione di ligazione.
   7. In una camera di umidificazione preriscaldata, incubare i vetrini a 37 °C per 30 minuti.
5. Amplificazione
   N.B.: la polimerasi va aggiunta alla soluzione di amplificazione subito prima che entri in contatto con il campione. L’Amplification buffer è sensibile alla luce. Proteggere dalla luce tutte le soluzioni che contengono tale tampone.
   1. Diluire 1:5 l’Amplification Buffer 5x in acqua a elevata purezza e miscelare. Per 40 µL di tampone di amplificazione 1x, aggiungere 8 µL dell’Amplification buffer 5x a 32 µL di acqua a elevata purezza. Preparare una quantità di soluzione sufficiente per tutti i campioni.
   2. Rimuovere la soluzione di ligazione picchiettando i vetrini.
   3. Effettuare 2 lavaggi lasciando ogni volta i vetrini per 5 minuti in Wash Buffer A 1x a temperatura ambiente.
   4. Durante i lavaggi, prelevare la polimerasi dal congelatore e riporla su un blocco congelante (-20 °C).
   5. Diluire 1:80 la polimerasi nel tampone di amplificazione 1x ottenuto al passaggio (a) e miscelare.
   6. Eliminare l’eccesso di Wash buffer picchiettando i vetrini e applicare la soluzione di amplificazione.
   7. In una camera di umidificazione preriscaldata, incubare i vetrini a 37 °C per 100 minuti.
6. Lavaggi finali
   N.B.: i reagenti sono sensibili alla luce, pertanto i vetrini vanno sempre tenuti al buio.
   1. Rimuovere la soluzione di amplificazione picchiettando i vetrini.
   2. Effettuare 2 lavaggi lasciando ogni volta i vetrini per 10 minuti in Wash Buffer B 1x a temperatura ambiente.
   3. Effettuare quindi un altro lavaggio lasciando i vetrini in Wash Buffer B 0,01x per 1 minuto.
7. Preparazione per l’acquisizione delle immagini
   N.B.: il Duolink^® In Situ Mounting Media with DAPI è una soluzione acquosa che non solidifica. Per sigillare il coprivetrino sul vetrino si può passare dello smalto per unghie trasparente sui margini del coprivetrino. Evitare che rimangano bolle d’aria sotto il coprivetrino.
   1. Rimuovere l’eccesso di Wash Buffer picchiettando i vetrini.
   2. Montare i coprivetrini sui vetrini usando una quantità minima di Duolink^® In Situ Mounting Medium with DAPI.
   3. Attendere 15 minuti prima di analizzare al microscopio a fluorescenza o confocale con obiettivo che ingrandisca almeno 20x.
   4. Dopo aver acquisito le immagini, conservare i vetrini al buio a 4 °C per un massimo di 4 giorni oppure a -20 °C per un massimo di 6 mesi

Risultati

Acquisizione delle immagini

Il risultato di un esperimento di PLA Duolink^® è visualizzabile mediante un microscopio a fluorescenza dotato dei filtri adatti al fluoroforo usato per la rivelazione. Il segnale del PLA Duolink^® è visibile sotto forma di puntini discreti fluorescenti in varie zone delle cellule studiate (Figura 1A). Le dimensioni del singolo segnale si attestano intorno ai sub-micrometri e possono trovarsi su più piani focali. Perciò, potrebbe essere necessario acquisire immagini di tutto lo spessore del campione. Se però tutte le immagini da confrontare vengono acquisite più o meno nella stessa posizione all’interno del campione, l’acquisizione può avvenire solo su un unico piano. Si sottolinea che spesso sono rilevabili alcuni segnali nei controlli negativi (per es., senza anticorpi primari, Figura 1B). Tuttavia, se si rilevano più di uno o due segnali ogni dieci cellule, allora potrebbe essere necessario titolare meglio gli anticorpi primari

Figura 1. Rivelazione di EGFR utilizzando PLA Duolink® su preparazioni ottenute con cytospin di cellule A431. Le figure mostrano una proiezione a intensità massima dell’immagine non elaborata basata su 20 piani zeta. I segnali PLA sono mostrati in rosso e i nuclei in blu. L’immagine dei nuclei è stata ottenuta su un piano zeta. A) Reazione positiva. B) Controllo negativo senza anticorpi primari.

Quando si acquisiscono le varie immagini di uno stesso esperimento, è importante usare sempre le stesse impostazioni (tempo di esposizione, filtri usati, ecc.). Per ottimizzare le impostazioni si possono usare i controlli positivi e negativi. Se il numero di segnali del PLA è alto, i segnali stessi possono unirsi/conglomerarsi (Figura 2). Ciò può verificarsi quando si studiano proteine altamente espresse oppure a causa di una sovraesposizione durante l’acquisizione dell’immagine. Per ottenere segnali singoli, prestare attenzione quando si configurano i parametri di acquisizione. Consultare la Guida alla risoluzione dei problemi per PLA Duolink^® per suggerimenti su come prevenire la conglomerazione dei segnali e altri possibili interventi di ottimizzazione.

Figura 2. Rivelazione di Her2 utilizzando PLA Duolink® su preparazioni FFPE di cellule SKBR-3 esprimenti livelli elevati di Her2. Le figure mostrano una proiezione a intensità massima dell’immagine non elaborata basata su 20 piani zeta. I segnali PLA sono mostrati in rosso e i nuclei in blu. L’immagine dei nuclei è stata ottenuta su un piano zeta. A) Reazione positiva. B) Controllo negativo senza anticorpi primari.

Analisi delle immagini

Per quantificare i segnali del PLA sono disponibili diversi strumenti per l’analisi delle immagini. I dati delle immagini possono essere analizzati in termini di intensità media della fluorescenza dei segnali del PLA e/o di numero totale di segnali del PLA per cellula o per area all’interno della cellula (Figura 3). Quindi la quantificazione viene calcolata rispetto ai controlli tecnici e/o biologici all’interno dello stesso esperimento. Tuttavia, una quantificazione affidabile si ottiene solo se i segnali PLA non si sono conglomerati e i pixel dell’immagine non sono arrivati a saturazione.

Figura 3. Analisi delle immagini mediante un software apposito. I nuclei colorati con DAPI (blu) sono stati rilevati automaticamente e le dimensioni del citoplasma sono state stimate dall’operatore (perimetri in verde). I segnali PLA mostrati in rosso corrispondono alla proteina bersaglio di interesse. I segnali PLA marcati con cerchi bianchi e i nuclei delineati in giallo sono quelli quantificati durante l’analisi.

Risoluzione dei problemi

Consultare la Guida alla risoluzione dei problemi per PLA Duolink^® per consigli e suggerimenti, linee guida generali per la risoluzione dei problemi e domande più frequenti (FAQ).

Il nostro team di supporto tecnico e il nostro rappresentante locale sono sempre a tua disposizione per assistenza sugli esperimenti.

Servizi su misura

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Bibliografia

1. Jarvius M, Paulsson J, Weibrecht I, Leuchowius K, Andersson A, Wählby C, Gullberg M, Botling J, Sjöblom T, Markova B, et al. 2007. In SituDetection of Phosphorylated Platelet-derived Growth Factor Receptor ? Using a Generalized Proximity Ligation Method. Mol Cell Proteomics. 6(9):1500-1509. https://doi.org/10.1074/mcp.m700166-mcp200

2. Söderberg O, Gullberg M, Jarvius M, Ridderstråle K, Leuchowius K, Jarvius J, Wester K, Hydbring P, Bahram F, Larsson L, et al. 2006. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nat Methods. 3(12):995-1000. https://doi.org/10.1038/nmeth947

3. Gullberg M, Gustafsdottir SM, Schallmeiner E, Jarvius J, Bjarnegard M, Betsholtz C, Landegren U, Fredriksson S. 2004. Cytokine detection by antibody-based proximity ligation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101(22):8420-8424. https://doi.org/10.1073/pnas.0400552101

4. Fredriksson S, Gullberg M, Jarvius J, Olsson C, Pietras K, Gústafsdóttir SM, Östman A, Landegren U. 2002. Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays. Nat Biotechnol. 20(5):473-477. https://doi.org/10.1038/nbt0502-473