Colatura manuale di gel per PAGE e SDS-PAGE con i kit mPAGE® TurboMix per la colatura di gel Bis-Tris
- L’elettroforesi su gel di poliacrilammide (PAGE)
- La chimica dei gel di poliacrilammide
- La colatura manuale dei gel di poliacrilammide
- Kit mPAGE® TurboMix per la colatura di gel Bis-Tris
- Video dimostrativo
- Protocollo mPAGE® TurboMix Quick Cast
- Preparare i campioni e far correre il gel
- Informazioni per gli ordini
L’elettroforesi su gel di poliacrilammide (PAGE)
L’elettroforesi su gel di poliacrilammide (PAGE) è una tecnica fondamentale utilizzata per separare proteine e altre macromolecole in base alla rispettiva mobilità elettroforetica. I gel di poliacrilammide si formano per polimerizzazione di monomeri di acrilammide e molecole di bis-acrilammide, che è l’agente che dà luogo ai legami trasversali. Il polimero di acrilammide e bis-acrilammide che si forma è provvisto di pori attraverso cui le proteine possono migrare.
I gel di poliacrilammide sono formati da due componenti: una porzione di gel cosiddetto di impaccamento (stacking gel) e una porzione di gel di separazione (resolving gel) detto anche gel di risoluzione. Il gel di impaccamento è un gel a bassa percentuale di acrilammide che serve a concentrare i campioni in una singola banda prima che passino attraverso il gel di separazione. Il gel di separazione è composto da acrilammide in una percentuale maggiore, in grado di separare le proteine in base alle dimensioni. La concentrazione di acrilammide è inversamente proporzionale alla dimensione dei pori: un aumento della concentrazione percentuale di acrilammide determina nel gel polimerico la formazione di pori più piccoli. I pori di piccole dimensioni sono indicati per separare le proteine a basso peso molecolare.
La chimica dei gel di poliacrilammide
La PAGE utilizza un sistema tampone discontinuo, nel quale lo ione del sistema tampone del gel differisce dallo ione del tampone di corsa. La differenza nella mobilità elettroforetica di questi due ioni determina un gradiente mobile di voltaggio attraverso cui migrano le proteine. La chimica del gel di Tris-glicina è il sistema PAGE più comunemente impiegato; fa uso di gel a base di Tris-HCl e di un tampone di corsa dato da Tris base e glicina. I gel di Tris-glicina operano in un ambiente fortemente alcalino, che può condurre a modifiche indesiderate delle proteine quali deamminazione e alchilazione. Di conseguenza, nei gel di Tris-glicina le bande proteiche possono risultare distorte o perdere risoluzione.
Di contro, i gel Bis-Tris sono caratterizzati da un sistema tampone in cui sono presenti Bis-Tris e HCl, e da un tampone di corsa costituito da MOPS o da MES. I gel Bis-Tris operano a pH neutro, condizione che riduce al minimo la modificazione delle proteine e promuove la stabilità delle proteine durante la corsa del gel. Come conseguenza, si ottengono una maggiore risoluzione e una maggiore accuratezza delle bande proteiche. I gel Bis-Tris possono vantare un periodo di conservazione più lungo rispetto ai gel Tris-glicina, che nel tempo cominciano pian piano a idrolizzarsi. I gel Bis-Tris sono in grado di combinarsi con i tamponi di corsa a base di MOPS o di MES; dalla differenza nella migrazione di questi due ioni conseguono range di separazione delle proteine differenti. È consigliabile utilizzare il MES quando la proteina di interesse è piccola (<50 kDa), mentre il MOPS va impiegato per risolvere proteine di dimensioni medio-grandi.
Inoltre, è importante tener conto di quale tampone del campione si utilizza nella preparazione delle proteine. Nei gel di Tris-glicina, per denaturare e rivestire le proteine di ioni SDS carichi negativamente si usa di norma il tampone Laemmli. I campioni vengono poi riscaldati fino a 100 °C, all’ebollizione, per facilitare la denaturazione delle proteine. Il riscaldamento del tampone Laemmli a 100 °C fa sì che il pH del tampone diventi fortemente acido: è stato dimostrato che una simile combinazione di calore e di acidità causa la rottura della catena polipeptidica, preferenzialmente a livello del legame peptidico Asp-Pro (Rittenhouse e Marcus, 1984). Ciò porta, nel corso dell’elettroforesi, alla comparsa di evidenti prodotti di degradazione proteica. Al contrario, i gel Bis-Tris fanno uso, per il campione, di un tampone LDS che nel corso della preparazione del campione mantiene un pH alcalino e che non necessita di temperature superiori ai 70 °C perché le proteine presenti nel campione vengano completamente denaturate. Questo tipo di preparazione conserva l’integrità proteica e riduce al minimo la lisi dei legami peptidici Asp-Pro.
| Tris-glicina | Bis-Tris | |
|---|---|---|
| pH di lavoro | 9,5 (alcalino) | 7,0 (neutro) |
| pH del tampone del campione | 5,2 | 8,5 |
| Fronti degli ioni | Tris (+) Glicina (-) | Tris (+) MOPS (-) MES (-) |
| Range di separazione delle proteine | 6 kDa – 400 kDa | 6 kDa – 400 kDa |
| Stabilità delle proteine nel corso della separazione | Possono verificarsi deamminazioni e alchilazioni | +++ |
| Impatto sui legami peptidici Asp-Pro | Un riscaldamento prolungato del tampone del campione con SDS causa la rottura del legame | Il tampone del campione LDS richiede un riscaldamento blando, per cui i legami Asp-Pro rimangono integri |
| Tempo di esecuzione | Ragionevole | Rapido |
| Conservazione | Limitata | 4 settimane + |
Figura 1.Confronto tra i gel Tris-Glicina (sinistra) e Bis-Tris (destra) I gel Tris-glicina e Bis-Tris sono stati colati manualmente con acrilammide al 12% e sono stati lasciati a riposo una notte per consentirne la polimerizzazione. I gel sono stati caricati con concentrazioni identiche di lisato cellulare di E. coli (corsie 3-6), standard proteico mPAGE® non colorato (corsie 2 e 7), e standard proteico mPAGE® colorato (corsia 1). I gel sono stati fatti correre nei tamponi di corsa Tris-glicina o MOPS, colorati con il colorante gel per proteine ReadyBlue™ per un’ora e decolorati con acqua deionizzata per un’ora.
La colatura manuale dei gel di poliacrilammide
Mentre i gel di poliacrilammide precolati possono essere acquistati per scopi specifici, come per esempio l’analisi di proteine di dimensioni differenti su un gradiente di acrilammide, molti ricercatori preferiscono colare manualmente i propri gel di poliacrilammide. Al confronto con i gel precolati, i gel di poliacrilammide preparati manualmente sono molto più economici; tuttavia, la preparazione dei reagenti e l’allestimento dell’attrezzatura possono rivelarsi noiosi e rappresentare un notevole impiego di tempo. La variabilità tra una preparazione del tampone del gel e l’altra può inoltre determinare prestazioni discontinue e una qualità del gel incostante.
Kit mPAGE® TurboMix per colatura di gel Bis-Tris
I kit mPAGE® TurboMix per la colatura di gel Bis-Tris eliminano la variabilità e riducono i tempi di colatura manuale fornendo acrilammide e soluzioni tampone pre-miscelate. Il kit include una soluzione di separazione di acrilammide al 20% con cui preparare la porzione di separazione del gel di acrilammide. La soluzione di risoluzione può essere diluita con acqua deionizzata per ottenere acrilammide nella percentuale desiderata, dall’8 % al 15 %. Il kit include inoltre una soluzione di impaccamento di acrilammide al 4% con cui preparare la porzione di impaccamento del gel di acrilammide. Queste due soluzioni sono state formulate per permettere di utilizzare il metodo Quick Casting, che elimina i tempi morti di polimerizzazione tra l’aggiunta del gel di separazione e quella del gel di impaccamento. Qui sotto un video dimostrativo e un protocollo breve.
Video dimostrativo: Cast your own polyacrylamide gels using mPAGE® TurboMix Bis-Tris Kits
PROTOCOLLO mPAGE® TurboMix QUICK CASTING
- Prepara il gel di separazione con la percentuale di acrilammide prescelta pipettando la soluzione di separazione mPAGE® TurboMix, acqua deionizzata, persolfato di ammonio al 10% (APS) e TEMED in un beaker di vetro o in una provetta a fondo conico puliti. I volumi riportati nelle Tabelle 2-4 possono essere moltiplicati all’occorrenza per la colatura di più gel alla volta. N.B.: Aggiungere APS al 10% e TEMED immediatamente prima della colata.
| (Per mini-gel di 1 mm di spessore) | |||||
| Gel di separazione (resolving gel) | Gel di impaccamento (stacking gel) | ||||
|---|---|---|---|---|---|
| Percentuale di gel | 8% | 10% | 12% | 15% | 4% |
| Soluzione di separazione mPAGE® TurboMix | 2,4 mL | 3,0 mL | 3,6 mL | 4,5 mL | n/d |
| Soluzione di impaccamento mPAGE® TurboMix | n/d | n/d | n/d | n/d | 2 mL |
| Acqua deionizzata | 3,6 mL | 3,0 mL | 2,4 mL | 1,5 mL | n/d |
| APS 10% | 30 µL | 30 µL | 30 µL | 30 µL | 20 µL |
| TEMED | 3 µL | 3 µL | 3 µL | 3 µL | 2 µL |
| (Per mini-gel di 0,75 mm di spessore) | |||||
| Gel di separazione (resolving gel) | Gel di impaccamento (stacking gel) | ||||
|---|---|---|---|---|---|
| Percentuale di gel | 8% | 10% | 12% | 15% | 4% |
| Soluzione di separazione mPAGE® TurboMix | 1,8 mL | 2,25 mL | 2,7 mL | 3,38 mL | n/d |
| Soluzione di impaccamento mPAGE® TurboMix | n/d | n/d | n/d | n/d | 1,5 mL |
| Acqua deionizzata | 2,7 mL | 2,25 mL | 1,8 mL | 1,12 mL | n/d |
| APS 10% | 22,5 µL | 22,5 µL | 22,5 µL | 22,5 µL | 15 µL |
| TEMED | 2,25 µL | 2,25 µL | 2,25 µL | 2,25 µL | 1,5 µL |
| (Per mini-gel di 1,5 mm di spessore) | |||||
| Gel di separazione (resolving gel) | Gel di impaccamento (stacking gel) | ||||
|---|---|---|---|---|---|
| Percentuale di gel | 8% | 10% | 12% | 15% | 4% |
| Soluzione di separazione mPAGE® TurboMix | 3,6 mL | 4,5 mL | 5,4 mL | 6,75 mL | n/d |
| Soluzione di impaccamento mPAGE® TurboMix | n/d | n/d | n/d | n/d | 3,0 mL |
| Acqua deionizzata | 5,4 mL | 4,5 mL | 3,6 mL | 2,25 mL | n/d |
| APS 10% | 45 µL | 45 µL | 45 µL | 45 µL | 30 µL |
| TEMED | 4,5 µL | 4,5 µL | 4,5 µL | 4,5 µL | 2 µL |
- Preparare il gel di impaccamento pipettando la soluzione di impaccamento mPAGE® TurboMix in un beaker di vetro o in una provetta a fondo conico puliti separati e aggiungere la quantità richiesta di TEMED e di APS al 10%. N.B.: aggiungere APS al 10% e TEMED immediatamente prima della colata.
- Mescolare delicatamente i reagenti, evitando la formazione di bolle d’aria nella miscela gel.
- Utilizzando una pipetta sierologica, riempire di gel di separazione ogni cassetta all’altezza desiderata.
- Posizionare la pipetta sierologica a metà della cassetta e aggiungere gradualmente il gel di impaccamento, fino al bordo superiore della piastra corta. Nel corso del pipettamento, è possibile la formazione di una lieve pendenza, che però finirà per livellarsi.
- Inserire rapidamente e con attenzione il pettine per evitare la presenza di bolle d’aria sotto i denti del medesimo.
- Lasciate che il gel polimerizzi per 1 ora.
- I gel possono essere utilizzati immediatamente o avvolti in fazzoletti di carta imbevuti di acqua DI e conservati in un contenitore a tenuta stagna a 4° C per un periodo massimo di 4 settimane.
Preparare i campioni e far correre il gel
- I gel Bis-Tris necessitano di una soluzione tampone per il campione con LDS, che è un sistema più alcalino rispetto al tampone del campione con SDS. I campioni possono subire un trattamento di riduzione ricorrendo a DTT o a β-mercaptoetanolo, oppure possono essere utilizzati in forma non ridotta in base all’applicazione desiderata. Preparate i vostri campioni in base a quanto riportato nella Tabella 5.
| In forma ridotta | In forma non ridotta | |
|---|---|---|
| Campione | (6,5 - X) µL | (7,5 - X) µL |
| Acqua DI | X µL | X µL |
| Tampone LDS a concentrazione 4X | 2,5 µL | 2,5 µL |
| DTT 1 M | 1 µL | N.A. |
| Volume totale | 10 μL | 10 μL |
- Riscaldare i campioni per 10 minuti a 70 °C (non portare a ebollizione)
- Caricare i campioni e gli standard proteici nei pozzetti.
- Aggiungere una egual quantità di tampone di caricamento a concentrazione 1X nei pozzetti vuoti.
- I gel possono essere fatti correre a 200 V fino a che il colorante o lo standard proteico raggiungono la fine del gel, approssimativamente per 30-60 minuti a seconda della percentuale di acrilammide.
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