Protocollo per PCR standard

Come effettuare la PCR

L’allestimento di una reazione a catena della polimerasi (PCR) standard richiede 4 passaggi:

1. Aggiunta dei reagenti necessari o della mastermix e del DNA stampo alle microprovette per PCR.
2. Miscelazione e centrifugazione.
   *Aggiunta di olio minerale per prevenire l’evaporazione in caso di termociclatore senza coperchio riscaldato.
3. Amplificazione secondo i parametri del termociclatore e i primer.
4. Valutazione del DNA amplificato mediante elettroforesi su gel di agarosio poi colorato con bromuro di etidio.

Questi passaggi sono descritti in maniera più dettagliata qui di seguito, corredati da consigli per la scelta dei materiali e dei reagenti. Il protocollo qui descritto è quello della PCR di base con Taq DNA polimerasi.

Passaggi del protocollo di PCR e componenti essenziali

La risoluzione dei problemi incontrati con una reazione di PCR dipende da molti fattori. Guarda questa animazione che mostra come, selezionando i componenti e le condizioni di ciclazione adatte alle proprie necessità, sia possibile ottenere risultati ottimali.

Nella sezione Protocolli della nostra Guida alle tecnologie della PCR sono disponibili ulteriori protocolli per altre polimerasi o per tecniche di PCR più avanzate.

Invece, se desideri approfondire il tema della PCR standard e di come funziona, visita la nostra pagina Principi fondamentali della PCR.

Reagenti: che cosa serve per una PCR?

Reagente usato nella PCR	Prodotto consigliato
Taq DNA polimerasi	L’operatore può scegliere la Taq DNA polimerasi in base alla propria preferenza (vedere la specifica Tabella delleTaq DNA polimerasi più sotto).
Acqua a grado PCR	Acqua reagente per PCR
Primer diluiti alla concentrazione di lavoro	Soluzioni madre da 10 µM sono sufficienti per la maggioranza dei saggi.
Oligo	Oligo personalizzati
DNA da amplificare	Fornito dall’operatore
Pipette dedicate
Termociclatore	Con blocchi dotati di pozzetti di varie dimensioni o multiformato
Puntali per pipette con filtro sterili
Provette per microcentrifuga da 1,5 mL con tappo a vite sterili	Provette per microcentrifuga marca Corning® con tappo a vite
Microprovette o piastre per PCR	La scelta dipende dal ciclatore:
	Microprovette singole per PCR da 200 µL a parete sottile
	Strisce di microprovette da 200 µL
	Piastre multipozzetto e sigilli per piastre
Mix di dNTP	Mix di desossinucleotidi contenenti dATP, dCTP, dGTP e dTTP 10 mM *Le mix pronte contengono già tutti i dNTP

Che cos’è la Taq DNA polimerasi?

La Taq DNA polimerasi è un enzima termostabile derivato da un batterio termofilo chiamato Thermus aquaticus. Si usa comunemente per amplificare i frammenti di DNA nella reazione di PCR. In particolare si impiega una forma ricombinante di questo enzima espressa in E. coli. Può essere riscaldato ripetutamente a temperature fino a 95 °C (come richiesto dalla tecnica di PCR) senza significativa perdita di attività. All’SDS-PAGE l’enzima è caratterizzato da un peso molecolare di circa 94 kDa e non mostra attività endonucleasica o esonucleasica rilevabile. Polimerizza il DNA in direzione 5'→3', mentre in direzione 5'→3’ ha attività esonucleasica. Ogni lotto di Taq DNA polimerasi viene testato sia relativamente all’amplificazione mediante PCR che nel sequenziamento del doppio filamento. L’enzima è fornito alla concentrazione di 5 unità/µL in abbinamento a un tampone di reazione 10x ottimizzato.

Taq DNA polimerasi standard

La tabella seguente aiuta a selezionare un mix appropriato di Taq DNA polimerasi in base alle proprie condizioni di reazione. La scelta può avvenire tra formulazioni trasparenti o colorate di rosso, con e senza cloruro di magnesio (MgCl₂), o tra una Readymix già pronta o una master mix con tampone e dNTP.

Con MgCl2		MgCl2 a parte	Readymix
Formulazione trasparente senza colorante	Con colorante rosso per caricare direttamente su gel	Formulazione trasparente senza colorante	Con colorante rosso per caricare direttamente su gel	Formulazione trasparente senza colorante
Taq DNA polimerasi di Thermus aquaticus (D1806)	REDTaq® DNA polimerasi (D4309)	Taq DNA polimerasi di Thermus aquaticus, senza MgCl2 (D4545)	Mix di reazione per PCR REDTaq® ReadyMix™ (R2523)	Mix di reazione per PCR ReadyMix™ Taq (P4600)

Definizione di unità: una unità incorpora in totale 10 nmol di desossiribonucleosidi trifosfato in un DNA precipitabile in acido in 30 minuti a 74 °C.

Procedura: passaggi della PCR

Le condizioni ottimali in base alla concentrazione di Taq DNA polimerasi, DNA stampo, primer e MgCl₂ dipendono dal sistema utilizzato. Potrebbe essere necessario determinare le condizioni ottimali di ciascun singolo componente. Ciò vale in particolare per la Taq DNA polimerasi, i parametri di ciclizzazione e la concentrazione di MgCl₂. Per definire l’efficienza ottimale si raccomanda di titolare l’enzima e l’MgCl₂.

1. Aggiungere i reagenti a una microprovetta di dimensioni appropriate nell’ordine specificato nella tabella (a seconda che si usino reagenti standard o la ReadyMix consultare la relativa tabella). Se le reazioni sono numerose, si consiglia di preparare una mastermix senza lo stampo da aliquotare nelle microprovette di reazione, per aggiungere solo alla fine lo stampo alle microprovette appropriate.
   

Reazione di PCR standard

Quantità	Componente	Concentrazione finale
w µL	Acqua
5 µL	Tampone per PCR 10x (P2192 o P2317)*	1x
1 µL	Mix di desossinucleotidi	200 µM
w µL	Primer forward (tipicamente lungo 15-30 basi)	0,1-0,5 µM
x µL	Primer reverse (tipicamente lungo 15-30 basi)	0,1-0,5 µM
0,5 µL	Taq DNA polimerasi*	0,05 unità/µL
y µL	DNA stampo (tipicamente 10 ng)	200 pg/µL
z µL	MgCl2 25 mM (usare solo con il tampone P2317)	0,1-0,5 mM
50 µL	Volume di reazione totale

*Acquistare il tampone e la Taq DNA polimerasi insieme: D1806, D4309 o D4545

Reazione di PCR con ReadyMix

Quantità	Componente	Concentrazione finale
25 µL	ReadyMix (R2523 o P4600)
w µL	Primer forward (tipicamente lungo 15-30 basi)	0,1-0,5 µM
x µL	Primer reverse (tipicamente lungo 15-30 basi)	0,1-0,5 µM
y µL	DNA stampo (tipicamente 10 ng)	200 pg/µL
z µL	Acqua
50 µL	Volume di reazione totale

2. Miscelare delicatamente con vortex e centrifugare brevemente per raccogliere tutti i componenti sul fondo della microprovetta.

N.B.: se si usa un termociclatore senza coperchio riscaldato, aggiungere 50 µL di olio minerale sopra la miscela di reazione di ogni microprovetta per prevenire l’evaporazione.

3. Amplificare. I parametri di amplificazione variano a seconda dei primer e del termociclatore utilizzato. Potrebbe essere necessario ottimizzare la procedura in base ai parametri dei singoli primer, dello stampo e del termociclatore.

Parametri di ciclizzazione tipici

Si consigliano 25-30 cicli di amplificazione.

Passaggio della PCR	Temperatura (°C)	Durata
Denaturazione dello stampo	94 °C	1 min
Appaiamento dei primer	55 °C	2 min
Estensione	72 °C	3 min

4. Il DNA amplificato può essere valutato mediante elettroforesi su gel di agarosio e successiva colorazione del gel con bromuro di etidio.

N.B.: lo strato di olio minerale può essere rimosso effettuando una singola estrazione con cloroformio (1:1), recuperando la fase acquosa.

Reagenti per l’elettroforesi degli acidi nucleici

• Agarosio (gel precolato, in polvere, ecc.)
• Tampone come MOPS-EDTA-sodio acetato, tris-acetato-EDTA (TAE) o tris-borato-EDTA (TBE)
• Soluzione per il caricamento su gel e tampone per caricare i campioni adatto all’RNA
• Colorante per elettroforesi o bromuro di etidio

1. Cheng S, Fockler C, Barnes WM, Higuchi R. 1994. Effective amplification of long targets from cloned inserts and human genomic DNA.. Proceedings of the National Academy of Sciences. 91(12):5695-5699. https://doi.org/10.1073/pnas.91.12.5695

2. Chou Q. 1992. Minimizing deletion mutagenesis artifact duringTaqDNA polymerase PCR byE.coliSSB. Nucl Acids Res. 20(16):4371-4371. https://doi.org/10.1093/nar/20.16.4371

3. Innis MA. 1995. PCR Strategies. New York: Academic Press.

4. Innis MA. 1990. PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. New York: Academic Press.

5. Innis MA, Myambo KB, Gelfand DH, Brow MA. 1988. DNA sequencing with Thermus aquaticus DNA polymerase and direct sequencing of polymerase chain reaction-amplified DNA.. Proceedings of the National Academy of Sciences. 85(24):9436-9440. https://doi.org/10.1073/pnas.85.24.9436

6. Newton CR. 1995. PCR: Essential Data. 1. Wiley-Blackwell.

7. Olive DM, Simsek M, Al-Mufti S. 1989. Polymerase chain reaction assay for detection of human cytomegalovirus.. 27(6):1238-1242. https://doi.org/10.1128/jcm.27.6.1238-1242.1989

8. Pääbo S, Gifford JA, Wilson AC. 1988. Mitochondrial DNA sequences from a 7000-year old brain. Nucl Acids Res. 16(20):9775-9787. https://doi.org/10.1093/nar/16.20.9775

9. Erlich HA. 1989. PCR technology : principles and applications for DNA amplification. New York: Stockton Press.

10. Sambrook J, Fritsch E, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

11. Sarkar G, Kapelner S, Sommer SS. 1990. Formamide can dramatically improve the specificity of PCR. Nucl Acids Res. 18(24):7465-7465. https://doi.org/10.1093/nar/18.24.7465

12. Winship PR. 1989. An lmproved method for directly sequencing PCR-amplified material using dimethyl sulphoxide. Nucl Acids Res. 17(3):1266-1266. https://doi.org/10.1093/nar/17.3.1266

Dichiarazione sulla Licenza del marchio

AVVISO AGLI ACQUIRENTI: AVVERTENZA SULLA LICENZA

L’acquisto di questo prodotto non implica la trasmissione di alcuna licenza per l’utilizzo di alcuno dei brevetti degli Stati Uniti N. 5.804.375, 5.994.056, 6.171.785, 6.214.979, 5.538.848, 5.723.591, 5.876.930, 6.030.787 e 6.258.569 né dei brevetti corrispondenti al di fuori degli Stati Uniti, così come di nessun altro brevetto o domanda di brevetto avente come oggetto i processi della nucleasi 5’ e dei coloranti che legano il DNA a doppio filamento. Per ulteriori informazioni contattare il Direttore Licenze, Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, California 94404, Stati Uniti.