Marcatura e rilevamento degli acidi nucleici
La gamma dei metodi usati per la marcatura e il rilevamento di acidi nucleici, prodotti della PCR e oligonucleotidi è molto vasta. I reagenti e le metodiche preferite dipendono da diversi fattori, tra cui il tipo di molecola da marcare e l'applicazione a cui essa è destinata. Per marcare gli acidi nucleici si ricorre sia a metodi enzimatici, sia chimici che consentono l’incorporazione di molecole di diverso tipo come fluorofori, enzimi ed elementi radioattivi.
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Marcatura di acidi nucleici e sonde
Gli acidi nucleici possono essere marcati lungo tutta la molecola o limitatamente alle estremità 5' e 3'. Le sonde di acidi nucleici sono particolarmente utili per i saggi di ibridazione, come il rilevamento dell’RNA nel Northern blotting o del DNA nel Southern blotting. Per distribuire il tracciante in tutta la sonda, vengono utilizzati diversi metodi, tra cui PCR con deossinucleotidi marcati (dNTP) o nucleotidi trifosfati (NTP), random priming e nick translation. La marcatura a livello delle estremità è particolarmente utile per i saggi che studiano le interazioni acido nucleico-proteina, in quanto evita l'ingombro sterico.
Saggi che prevedono la marcatura e il rilevamento di acidi nucleici
La tecnica di rilevamento usata dipende dal tipo di marcatura utilizzata: il rilevamento colorimetrico è spesso utilizzato per le sonde marcate con enzimi, mentre l'autoradiografia è adatta per le sonde radioattive. Le sonde più comunemente usate sono quelle marcate con digossigenina (DIG) o fluoresceina; esse possono essere utilizzate in combinazione, per facilitare il rilevamento multicolore delle sonde quando accoppiate a reazioni colorimetriche (ad es. fosfatasi alcalina). Un ulteriore metodo di marcatura consiste nell’incorporazione di biotina-16-dUTP mediante PCR, possibile con la maggior parte delle DNA polimerasi. La FISH (ibridazione in situ fluorescente) utilizza sonde fluorescenti per rilevare specifiche sequenze di DNA; il successo del rilevamento e delle analisi successive dipendono in parte anche dalla sensibilità e dalla risoluzione del microscopio a fluorescenza a disposizione del ricercatore.
Applicazioni di DNA e RNA marcati
Il trasferimento di macromolecole su membrane in fase solida è noto come blotting. Grazie alla specificità delle sonde marcate, l'ibridazione tra acido nucleico e sonda fornisce ai ricercatori la possibilità di rilevare sequenze sia di DNA che di RNA in miscele complesse di acidi nucleici. Inoltre, queste metodiche consentono di raccogliere informazioni preziose circa, ad esempio, l'espressione genica, il numero di copie e le dimensioni dell'mRNA a seconda del test utilizzato. Anche l’ibridazione in situ viene comunemente usata dai ricercatori per rivelare una o più sonde marcate con differenti marcature (ad esempio con DIG e fluoresceina).
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