Bei der Echtzeit-PCR, die auch als quantitative oder qPCR bezeichnet wird, wird die tatsächliche Menge des in einem bestimmten Zyklus vorhandenen PCR-Produkts bestimmt. Durch die Verwendung eines fluoreszierenden Reporters in der PCR-Reaktion ermöglicht dieses Verfahren die Messung der DNA-Erzeugung im qPCR-Assay. Es gibt zwei Methoden der qPCR: SYBR Green- und sondenbasiert.
SYBR Green-basierte qPCR
SYBR Green qPCR ermöglicht die Überwachung der Amplifikation einer beliebigen doppelsträngigen DNA-Sequenz. Es sind keine Sonden erforderlich, wodurch die Kosten für die Einrichtung und Durchführung des Assays entfallen. Außerdem können sich mehrere Farbstoffe an ein einzelnes amplifiziertes Molekül binden, wodurch die Empfindlichkeit beim Nachweis von Amplifikationsprodukten erhöht wird.
SYBR Green qPCR Video-Transkript
Bei der Echtzeit-PCR, die auch als quantitative oder qPCR bezeichnet wird, wird die tatsächliche Menge des in einem bestimmten Zyklus vorhandenen PCR-Produkts bestimmt. Durch die Verwendung eines fluoreszierenden Reporters in der PCR-Reaktion ermöglicht dieses Verfahren die Messung der DNA-Erzeugung im qPCR-Assay.
In einer SYBR Green qPCR-Reaktion steht das Template zur Verfügung, welche die Zielsequenz von Interesse enthält. Außerdem werden Primer, dNTP und eine DNA-Polymerase der Wahl benötigt. Der Farbstoff SYBR Green I ist in der Regel in der Reaktionsmischung enthalten, welche die DNA-Polymerase enthält.
Die Denaturierung ist der erste Schritt in der PCR-Reaktion. Der Thermocycler wird auf etwa 95 Grad Celsius erwärmt, wodurch die doppelsträngige DNA-Helix in zwei einzelsträngige DNA-Templates aufgeschmolzen wird.
Während des Hybridisierungsschritts kühlt die Temperatur auf 45-65 Grad Celsius herunter und die einzelsträngigen Primer lagern sich an die entsprechenden Enden der Zielsequenz an. Während des Zyklus lagert sich die DNA-Polymerase am geprimten Template an und beginnt mit dem Einbau komplementärer Nukleotide.
Während der Elongation steigt die Temperatur schließlich leicht auf 65-75 Grad Celsius an. Die DNA-Polymerase erweitert den sequenzspezifischen Primer durch den Einbau von Nukleotiden, die komplementär zum DNA-Template sind.
SYBR Green I bindet alle neu synthetisierten doppelsträngigen DNA-Komplexe und fluoresziert. Die Fluoreszenz akkumuliert mit fortschreitendem PCR-Zyklus und wird am Ende jedes PCR-Zyklus gemessen. Die Intensität der von SYBR Green I erzeugten Fluoreszenz über dem Hintergrundniveau (der Cq-Wert) wird gemessen und zur Quantifizierung der Menge der neu erzeugten doppelsträngigen DNA verwendet.
Nachdem der Denaturierungs-, Hybridisierungs- und Extensionszyklus etwa 35-40 Mal wiederholt wurde, kann die Analyse beginnen. Die Cq-Werte können zur Quantifizierung von DNA-Ausgangsmengen, zur Erstellung einer Standardkurve für Genexpressionsstudien oder für andere Analysen verwendet werden.
SYBR Green qPCR ist eine hervorragende Option zur Überwachung der Amplifikation jeder doppelsträngigen DNA-Sequenz. Es sind keine Sonden erforderlich, wodurch die Kosten für die Einrichtung und Durchführung des Assays entfallen. Außerdem können sich mehrere Farbstoffe an ein einzelnes amplifiziertes Molekül binden, wodurch die Empfindlichkeit beim Nachweis von Amplifikationsprodukten erhöht wird.
Die Kompatibilität der Geräte ist für die qPCR entscheidend. Es ist entscheidend, das richtige Produkt für Ihr Gerät auszuwählen. Darüber hinaus unterscheiden sich die qPCR-Methoden in Bezug auf Genauigkeit, Geschwindigkeit und Komfort. Wir empfehlen die Verwendung einer Auswahlhilfe für die PCR und den Kontakt zu unserem technischen Support-Teams bei der Auswahl der für Sie geeigneten Produkte unter SigmaAldrich.com/PCR.
Die sondenbasierte qPCR ermöglicht eine spezifische Hybridisierung. Die zielgerichtete Natur der sondenbasierten qPCR führt zu einem niedrigen Hintergrund und schließt falsch-positive Ergebnisse aus. Es ist ebenfalls möglich, die Sonden mit verschiedenen, unterscheidbaren Reporterfarbstoffen zu markieren, um die Amplifikation von zwei verschiedenen Sequenzen in einem Reaktionsröhrchen zu ermöglichen.
Videotranskript zur sondenbasierten qPCR
Bei der Echtzeit-PCR, die auch als quantitative oder qPCR bezeichnet wird, wird die tatsächliche Menge des in einem bestimmten Zyklus vorhandenen PCR-Produkts bestimmt. Durch die Verwendung eines fluoreszierenden Reporters in der PCR-Reaktion ermöglicht dieses Verfahren die Messung der DNA-Erzeugung im qPCR-Assay.
In einer sondengestützten qPCR-Reaktion steht das Template zur Verfügung, welche die Zielsequenz von Interesse enthält. Außerdem werden Primer, dNTP und eine DNA-Polymerase der Wahl benötigt. Darüber hinaus wird eine Sonde benötigt, die sowohl mit einem Reportermolekül als auch mit einem Quenchermolekül markiert ist. Normalerweise werden Sonden als separate, kundenspezifische Produkte verkauft, da sie spezifisch für die Zielsequenz sind.
Die Denaturierung ist der erste Schritt in der PCR-Reaktion. Der Thermocycler wird auf etwa 95 Grad Celsius erwärmt, wodurch die doppelsträngige DNA-Helix in zwei einzelsträngige DNA-Templates aufgeschmolzen wird.
Während des Hybridisierungsschritts kühlt die Temperatur auf 45-65 Grad Celsius herunter und die einzelsträngigen Primer lagern sich an die entsprechenden Enden der Zielsequenz an. Während des Zyklus lagert sich die DNA-Polymerase am geprimten Template an und beginnt mit dem Einbau komplementärer Nukleotide.
Während der Elongation steigt die Temperatur schließlich leicht auf 65-75 Grad Celsius an. In dieser Phase erweitert die DNA-Polymerase den sequenzspezifischen Primer durch den Einbau von Nukleotiden, die komplementär zum DNA-Template sind. Die DNA-Polymerase verdrängt dann das Reportermolekül von der Sonde, was zu einer Fluoreszenz führt.
Die Fluoreszenz akkumuliert mit fortschreitendem PCR-Zyklus und wird am Ende jedes PCR-Zyklus gemessen. Die Intensität der vom Reportermolekül erzeugten Fluoreszenz über dem Hintergrundniveau (der Cq-Wert) wird gemessen und zur Quantifizierung der Menge der neu erzeugten doppelsträngigen DNA-Stränge verwendet.
Nachdem der Denaturierungs-, Hybridisierungs- und Extensionszyklus etwa 35-40 Mal wiederholt wurde, kann die Analyse beginnen. Die Cq-Werte können zur Quantifizierung von DNA-Ausgangsmengen, zur Erstellung einer Standardkurve für Genexpressionsstudien oder für andere Analysen verwendet werden.
Sondenbasierte qPCR ist eine hervorragende Option für spezifische Hybridisierung ohne falsch positiven Ergebnisse und mit Amplifikation von zwei verschiedenen Sequenzen in einem Reaktionsröhrchen.
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