Optimierung für die Hochdurchsatzanalyse von Cannabinoiden in einer Vielzahl von Matrizes mit der Ascentis® Express C18-Säule
Seamus Riordan-Short, Senior Chemist1, Yevgen Kovalenko, Technician1, Matthew Noestheden, Director of Operations1, Jennifer King, Program Marketing Manager2, Katherine K. Stenerson, Analytical Sciences Liaison2
1Supra Research and Development, 2Merck
Mit der zunehmenden Gesetzgebung zu Cannabis und Hanf ist die Nachfrage nach der Entwicklung und Validierung von genauen und präzisen Testmethoden für die Quantifizierung der Wirksamkeit gestiegen. Cannabinoide stellen eine Reihe von Herausforderungen dar, hinzu kommt der Umgang mit einer Vielzahl von Matrixtypen. HPLC/UV ist die am häufigsten verwendete Technik und die HPLC-Parameter müssen optimiert werden, um eine gute Trennung und eine stabile Retention über viele Injektionen hinweg und mit verschiedenen Probentypen sicherzustellen.
Wissenschaftler von Supra Research and Development ("SupraRnD") in Kelowna, British Columbia, Kanada (www.suprarnd.ca) haben eine zuverlässige Methode zum Nachweis von Cannabinoiden mit hohem Durchsatz entwickelt, die für eine Vielzahl von Matrizes geeignet ist. Das Engagement von SupraRnd im Bereich der Cannabistests nahm im Jahr 2015 seinen Anfang, als das Unternehmen eine Lizenz von Health Canada für die Prüfung von Cannabisprodukten erhielt. Im Jahr 2018 war das Unternehmen eines der ersten Labore in Kanada, das die Akkreditierung nach ISO 17025 für Cannabistests absolvierte. Ihre Wirksamkeitsmethode hat sich im Laufe der Zeit weiterentwickelt, um den sich ändernden Anforderungen ihrer Kunden gerecht zu werden, und ist nun für mehrere verschiedene Matrizes validiert.
Versuchsbedingungen
Ganze Blütenproben wurden in hermetisch verschlossenen Beuteln bei -80 °C für mindestens 30 Minuten eingefroren und anschließend sofort homogenisiert.* Bei der Analyse von Cannabisblüten ist es von entscheidender Bedeutung, dass eine repräsentative Probe homogenisiert und Teilproben entnommen werden, da die Phytocannabinoid-Konzentrationen zwischen und innerhalb einer bestimmten Pflanze erheblich variieren können. Der anschließende Arbeitsablauf umfasste eine einfache Extraktion einer 0,2 g großen Probe mit Methanol, gefolgt von einer Ultraschallbehandlung und Stabilisierung des Extrakts bei -20 °C für 1 Stunde. Die Probe wurde dann zentrifugiert und der Überstand für die HPLC-Analyse 100:1 verdünnt. Durch die geringe Probengröße in Kombination mit der Verdünnung vor der Analyse wird das Potenzial für matrixbedingte Probleme minimiert (z. B. Interferenzen, Langlebigkeit der Säule usw.). Der HPLC-Anteil der Analyse hat eine Zykluszeit von 8 Minuten von Injektion zu Injektion. Dies ermöglicht 60 Injektionen pro 8-Stunden-Intervall, wodurch eine größere Anzahl Kundenproben in einer Arbeitsschicht durchgeführt werden kann. Die mit dieser Methode analysierten Cannabinoide sind in Tabelle 1 aufgeführt.
HPLC-Analyse von Cannabinoiden
Die finalen, optimierten HPLC-Parameter sind in Tabelle 2 zusammengefasst.
Bei der Entwicklung dieser Methode wurden folgende Überlegungen angestellt:
- Chromatographische Auflösung aller 17 Verbindungen.
- Zykluszeit (d. h. Laufzeit plus Äquilibrierung) von insgesamt weniger als 10 Minuten.
- Eine robuste Methode mit gleichbleibender Leistung für
- > 1000 Injektionen mit stabilen Retentionszeiten bei gleichzeitiger Beibehaltung einer guten Peak-Form und Peak-Antwort.
- Geeignet für die Verwendung mit verschiedenen Matrizes wie Blüten, Schokolade, Salben, Öle, Konzentrate, usw.
Methodenkalibrierung
Die Kalibrierung der Methode reichte von 0,01 µg/ml bis 40 ug/ml. Dies erforderte bei einigen Proben eine starke Verdünnung, um in diesen Analysebereich zu gelangen. Zur Kalibrierung und Dotierung wurden zertifizierte Referenzmaterialien (CRM) von Cerilliant® verwendet. Die einzelnen Cannabinoid-CRM zu 1 mg/ml (mit Ausnahme von CBLA zu 0,5 mg/ml) wurden zusammen mit der internen Standardlösung direkt in die HPLC-Komponente A der mobilen Phase verdünnt, um eine 17-Komponenten-Stammlösung zu 40 µg/ml herzustellen. Dieser Stamm wurde dann in einer 30:70-Mischung der mobilen HPLC-Phasen A:B für die Kalibrierungsstandards mit niedrigerer Konzentration weiter verdünnt.
HPLC-Säulen: Ascentis® Express C18
Die für die Analyse verwendete HPLC-Säule war eine Ascentis® Express C18-Säule, 15 cm x 2,1 mm I.D., 2 µm. Ascentis®-Express-Säulen enthalten Fused-Core®-Partikel mit einem festen Kern und einer porösen Hüllenarchitektur, die auch als oberflächlich porös bezeichnet wird. Diese Partikelstruktur bietet eine höhere Trenneffizienz als vollständig poröse Partikel der gleichen Größe und ermöglicht kürzere Analysezeiten bei geringerem Rückdruck als bei Ansätzen mit kleineren (< 2 µm) vollständig porösen Partikeln. Die Partikelarchitektur der Ascentis®-Express-Säulen ermöglicht die Verwendung größerer Partikel, wodurch sie sowohl für konventionelle als auch für UHPLC-Systeme geeignet sind. Für diese Methode verwendete SupraRnD ein UHPLC-System, obwohl mit der geeigneten Geräteoptimierung auch mit herkömmlichen Systemen eine erfolgreiche Trennung herbeigeführt werden kann. Konkret geht es darum, die Systemdispersion zu minimieren. Dies kann durch eine Verringerung der Rohrlänge und des Innendurchmessers des Säuleneinlasses und -auslasses sowie bei UV-Detektoren durch die Verwendung einer Durchflussküvette mit einem Volumen von < 5 µl erreicht werden.
Methodenvalidierung und Leistung
Bevor die Ascentis®-Express-C18 für die Methodenvalidierung ausgewählt wurde, untersuchte SupraRnD sechs andere Säulen mit ähnlicher Chemie von verschiedenen Herstellern. Sie konnten mit mehreren Säulen eine chromatographische Auflösung und eine kurze Laufzeit erreichen, stellten jedoch fest, dass die Ascentis®-Express-C18 die einzige Säule war, die eine stabile Retentionszeit bot – insbesondere für die sauren Cannabinoide. Dies wird in Abbildung 1 deutlich, in der Chromatogramme eines Kontrollstandards bei Injektion #1 und Injektion #1140 dargestellt sind, zwischen denen zahlreiche Probenextrakte durchgeführt wurden.
Abbildung 1.Cannabinoid-Standard auf der Ascentis®-Express-C18-Säule; Vergleich von Injektion Nr. 1 und Injektion Nr. 1140.
Die Methode unter Verwendung der Ascentis®-Express-C18 wurde in mehreren verschiedenen Matrizen validiert, darunter Hopfenblüten (als Ersatzmatrix für Cannabis), Hanfsamenöl, CBD-Konzentrat und topische Salben. Die Wiederfindungsrate von Hopfen lag zwischen 85 und 115 % bei einem Dotierbereich von 0,05 bis 20 Gew.-%. Eine Zusammenfassung dieser Validierung sowie der anderen Matrizes ist in Tabelle 3 aufgeführt. Die für die Cannabinoide (mit Ausnahme von CBDV, CBG, CBD und CBC im Konzentrat) erreichten Berichtswerte der Methoden (MRL) betrugen alle 0,05 Gew.-%. Die Wiederholpräzision, ausgedrückt in %RSD, lag bei allen Matrizes bei < 4 %. Eine weitere Bewertung erfolgte durch Eignungsprüfungen, bei denen die Methode für Proben von Cannabisblüten und Hanföl erfolgreich war.
* CBD-Wiederfindung nicht quantifiziert, da hohe Werte aufgetreten sind
** Die Δ9-THC-Wiederfindung konnte aufgrund der hohen aufgetretenen Werte nicht quantifiziert werden
ŦCBDV, CBG, CBD, CBC, die in der Matrix enthalten sind, führten zu Problemen, durch welche die Berechnung der MRL für diese Verbindungen verhindert wurde
In Abbildung 2 sind Beispielchromatogramme von Hopfenblüten dargestellt, die mit 1 % w/w und der MRL-Konzentration von 0,05 % w/w dotiert wurden. Bei der viel niedrigeren Dotierstufe, in der die Matrixinterferenz deutlicher war, waren alle 17 Cannabinoide von den Hintergrundpeaks unterscheidbar und konnten analysiert werden. Die spezifischen Interferenzen, die neben THCV und CBL eluieren, sind wahrscheinlich auf spezifische Terpene in der Hopfenprobe zurückzuführen. Diese Peaks wurden in Cannabisblüten nicht beobachtet. In einer dotierten Salbenprobe (Abbildung 3) wurden alle Cannabinoide eindeutig im Bereich der MRL nachgewiesen.
Abbildung 2.Hopfenblüten, die zu 1% mit Cannabinoiden dotiert sind.
Hopfenblüten, die zu 0,05 % mit Cannabinoiden dotiert sind.
Abbildung 3.Salbe aus Cannabisextrakt, dotiert mit 0,05 Gew.-%.
Bis heute wurden mehr als 1550 Injektionen mit einer einzigen Ascentis® Express C18-Säule durchgeführt. SupraRnD hat festgestellt, dass es bisher weder zu einem signifikanten Anstieg des Säulenrückdrucks noch zu einer Verschlechterung der Leistung gekommen ist. Die Daten, die im Laufe dieser Nutzung über den Rückdruck gesammelt wurden, zeigten einen Nettoanstieg von 2 % auf. Es wurde darüber hinaus festgestellt, dass die Retentionszeiten stabil waren, sodass Cannabinoid-Peaks in Proben mit größerer Sicherheit identifiziert werden konnten. Ein Beispiel ist in Abbildung 4 dargestellt, in der zwei verschiedene Matrizes, dunkle Schokolade und Cannabisblüten, verglichen werden. Beide Proben enthielten messbare Mengen an Δ9-THC und der Unterschied in der Retentionszeit zwischen den beiden Matrizes war minimal.
Abbildung 4.Vergleich des Elutionsmusters zwischen dunkler Schokolade und Cannabisblütenproben (nicht dotiert).
Schlussfolgerung
Nach der Evaluierung verschiedener HPLC-Säulen hat SupraRnD erfolgreich eine robuste und widerstandsfähige Methode unter Verwendung der Ascentis® Express C18-Säule für die Analyse von 17 Cannabinoiden in einer Vielzahl von Matrizes entwickelt. Bislang wurde die Methode erfolgreich auf fünf verschiedene Probentypen angewandt, darunter Blüten, Salben, Schokolade, Konzentrate und Gummibärchen. Die Ascentis®-Express-C18-Säule wurde für die endgültige Methode aufgrund der Stabilität der Retentionszeit bei wiederholter Verwendung und aufgrund der Fähigkeit zur Aufrechterhaltung der chromatographischen Leistung für die Cannabinoide ausgewählt. Darüber hinaus hat die derzeit verwendete Säule im Verlauf von mehr als 1500 Injektionen nur einen minimalen Anstieg des Rückdrucks aufgezeigt.
* Nach der Veröffentlichung dieser Daten entfernte SupraRnD später den Gefrierschritt und homogenisierte die ganzen Blüten bei Raumtemperatur. Dies wurde vorgenommen, um die Möglichkeit einer Aufblähung des Feuchtigkeitsgehalts durch Kondensation von atmosphärischem Wasser auf den kalten Proben zu verringern.
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