3D-Bioprinting: Leitfaden für die Auswahl von Biotinte

Was ist 3D-Bioprinting?

Das 3D-Bioprinting ermöglicht die Herstellung von präzise kontrollierten 3D-Zellmodellen und Gewebekonstrukten, indem anatomisch geformte Substrate mit gewebeähnlicher Komplexität hergestellt werden. Aufgrund des hohen Maßes an Kontrolle über Struktur und Zusammensetzung hat das 3D-Bioprinting das Potenzial, vielen kritischen Anforderungen in der medizinischen Forschung zu entsprechen, denen bisher nicht begegnet werden konnte, darunter Anwendungen in der Kosmetikprüfung, der Wirkstoffentdeckung/Frühforschung, der regenerativen Medizin und im funktionellen Organersatz.¹ Personalisierte Krankheitsmodelle können mit vom Patienten stammenden Stammzellen, wie induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) oder mesenchymalen Stammzellen, erstellt werden. Je nach Anwendung kann eine Reihe von Materialien, Methoden und Zellen eingesetzt werden, um das gewünschte Gewebekonstrukt zu erhalten (Abbildung 1). Ausführlichere Informationen, einschließlich Fachartikeln zum 3D-Bioprinting, Protokollen und zugehörigen Produkten, finden Sie in unserem Handbuch zum 3D-Bioprinting.

Abbildung 1. 3D-Bioprinting von Gewebe und Organen. Biotinten werden durch die Kombination aus kultivierten Zellen und verschiedenen biokompatiblen Materialien hergestellt. Die Biotinten können dann im 3D-Bioprinting-Verfahren zu funktionalen Gewebekonstrukten für das Wirkstoffscreening, die Krankheitsmodellierung und In-vitro-Transplantation verarbeitet werden.

Was sind Biotinten?

Biotinten enthalten lebende Zellen und Biomaterialien, welche die Umgebung der extrazellulären Matrix nachahmen und die Zelladhäsion, -proliferation und -differenzierung nach dem Druck unterstützen. Im Gegensatz zu herkömmlichen 3D-Druckmaterialien müssen Biotinten bestimmte Eigenschaften aufweisen:

• Drucktemperaturen, welche die physiologischen Temperaturen nicht überschreiten
• Milde Vernetzungs- oder Gelierungsbedingungen
• Bioaktive Komponenten, die nicht toxisch sind und nach dem Druck von Zellen verändert werden können

Biotinten für den extrusionsbasierten Druck: Verkapselung von Zellen in Hydrogelen

Die Verkapselung von Zellen in Hydrogelen wird im 3D-Bioprinting eingesetzt, um lebende Gewebestrukturen zu schaffen, indem multizelluläre Bioprinting-Bausteine gebildet werden. Die Zellverkapselung ermöglicht im Vergleich zu anderen Methoden und Materialien eine präzise Kontrolle über die Zellanhaftung und die räumliche Verteilung der Zellen und Biomoleküle innerhalb des Gerüsts.¹ Die Kombination mehrerer Zelltypen und Wachstumsfaktoren in einem vorgegebenen Muster ermöglicht die Herstellung hochkomplexer Gewebekonstrukte.³ Neben der Biokompatibilität müssen Bioprinting-Materialien, die für die Verkapselung von Zellen verwendet werden, einen hohen Wassergehalt und eine hohe Porosität aufweisen, damit die eingekapselten Zellen Nährstoffe aufnehmen und Abfallstoffe abtransportieren können.¹ Als in Wasser gequollene, poröse Netzwerke sind Hydrogele ideale Materialien für die Zellverkapselung, die Gewebezüchtung und 3D-Bioprinting-Anwendungen. Hydrogele für das 3D-Bioprinting müssen außerdem eine einstellbare Substratsteifigkeit aufweisen und eine Neugestaltung des Netzwerks nach dem Druck ermöglichen, damit sich Zellen ausbreiten, migrieren, proliferieren und interagieren können.⁹ Es wird eine Vielzahl von Materialien für Biotinten verwendet, zu den beliebtesten Materialien gehören dabei Gelatine-Methacryloyl (GelMA), Kollagen, Poly(ethylenglykol) (PEG), Pluronic^®, Alginat und dezellularisierte Materialien auf Basis der extrazellulären Matrix (EZM) (Tabelle 1).

Biotintenmaterialien vorgestellt: Gelatine-Methacryloyl (GelMA)

Gelatine-Methacryloyl (GelMA) kann zur Bildung von quervernetzten Hydrogelen für die Gewebezüchtung und den 3D-Druck verwendet werden. Biotinten auf GelMA-Basis zeichnen sich durch hervorragende Zytokompatibilität, einstellbare Substratsteifigkeit, verbesserte Druckbarkeit und schnelle Quervernetzung bei Bestrahlung mit UV- oder sichtbarem Licht aus (je nach Identität des Photoinitiators).¹¹ GelMA wird für die Morphogenese von Endothelzellen, Kardiomyozyten, Epidermisgewebe, injizierbare Gewebekonstrukte, Differenzierung der knochenbildenden Zellen und Knorpelregeneration verwendet. Gelatine-Methacryloyl wurde auch in Mikrosphären und Hydrogelen für Wirkstofftransport-Anwendungen eingesetzt.

Abbildung 2. Gelatine-Methacryloyl

Azelluläre Materialien: Strukturelle Gerüste und Polymere

Neben Biotinten werden auch azelluläre Materialien in durch 3D-Bioprinting erzeugten Strukturen verwendet.² Azelluläre Materialien bieten in der Regel strukturelle Unterstützung für Gewebekonstrukte und können in Verbindung mit Biotinten funktionelle, im Bioprinting gedruckte Gewebe erzeugen. Azelluläre Materialien sind poröse Strukturen, die sowohl die mechanischen als auch die biochemischen Eigenschaften der nativen extrazellulären Matrix (EZM) nachahmen.⁴ Die Porosität ermöglicht die Zellmigration, das Gewebewachstum, die Gefäßbildung und die Zellviabilität innerhalb dieser strukturellen Konstrukte.⁶ Darüber hinaus müssen azelluläre Materialien auch die notwendige Oberflächenchemie für die Zellanhaftung, -proliferation und -differenzierung aufweisen.⁵ Zu den gängigen azellulären Materialien gehören: Kollagen, Fibrin, Chitosan, Nanocellulose, Polymilchsäure (PLA), Polycaprolacton (PCL), Hydroxylapatit (HA) und β-Tricalciumphosphat (β-TCP) (Tabelle 1).

Biotintenmaterial-Bausteine

Tabelle 1 Biomaterialien, die üblicherweise beim 3D-Bioprinting verwendet werden.

Biotintenmaterial	Überblick	Vorteil	Nachteil
Agarose	Polysaccharid aus Seetang extrahiert	Ungiftige Quervernetzung Hohe Stabilität	Nicht abbaubar; Schlechte Zelladhäsion
Alginat	Natürlich gewonnenes Biopolymer aus Braunalgen	Milde Quervernetzungsbedingungen (Ca2+) Hohe Geliergeschwindigkeit Hohe Biokompatibilität	Langsame Abbaukinetik; Schlechte Zelladhäsion
Chitosan	Polysaccharid, das aus dem äußeren Skelett von Schalentieren (z. B. Garnelen) gewonnen wird. Chitosan, das nicht von Tieren stammt, kann durch Pilzfermentation gewonnen werden.	Hohe Biokompatibilität Antibakterielle Eigenschaften	Langsame Geliergeschwindigkeit
Kollagen	Primäres Strukturprotein, das in der Haut und anderen Bindegeweben vorkommt	Hohe biologische Relevanz	Säurelöslich
Dezellularisierte EZM	Isolierte extrazelluläre Matrix eines Gewebes aus bewohnenden nativen Zellen	Hohe biologische Relevanz Gewebespezifisch Hohe Zellüberlebensrate	Undefiniert und inkonsistent; Verlust der ursprünglichen EZM-Organisation; Geringe Stabilität
Fibrin/Fibrinogen	Unlösliches Protein, das bei der Blutgerinnung gebildet wird	Hohe biologische Relevanz Hohe Geliergeschwindigkeit	Eingeschränkte Druckfähigkeit
Gelatine	Proteinsubstanz, die aus teilweise hydrolysiertem Kollagen gewonnen wird	Hohe Biokompatibilität Hohe Wasserlöslichkeit Thermoreversible Gelierung	Geringe Formtreue; Begrenzte Steifigkeit
Graphen	Material auf Kohlenstoffbasis, das als eine ein Atom dicke Graphitplatte bezeichnet werden kann	Flexibel Elektrisch leitfähig	Geringe biologische Relevanz
Hyaluronsäure (HA)	Nicht-sulfatiertes Glykosaminoglykan, das in Binde-, Epithel- und Nervengeweben weit verbreitet ist.	Hohe Geliergeschwindigkeit Fördert die Zellproliferation	Schlechte Stabilität
Hydroxylapatit	Natürlich vorkommende Mineralform von Calciumapatit, das in Zähnen und Knochen vorkommt	Hohe Festigkeit und Steifigkeit	Geringe Druckfähigkeit; Begrenzte Gewebespezifität
PCL/PLA/PLGA	Biologisch abbaubare, thermoplastische Polymere und/oder Copolymere	Hohe Festigkeit und Steifigkeit	Geringe Zelladhäsion und -proliferation
Pluronic® F127	Poly(ethylenoxid)- und Poly(propylenoxid)-Blockcopolymer	Druckbar bei Raumtemperaturen Scherverdünnendes Material	Nicht geeignet für die Langzeit-Zellkultur

Welche 3D-Bioprinting-Methode sollte verwendet werden?

Je nach Art der gewählten Tinte (Biotinte oder azelluläre Materialien) und der Komplexität des finalen Gewebekonstrukts können verschiedene 3D-Druckverfahren eingesetzt werden (Abbildung 1). Die Vor- und Nachteile der gängigen Methoden sind in der nachstehenden Tabelle aufgeführt (Tabelle 2).

Tabelle 2. Zusammenfassung der 3D-Bioprinting-Methoden.

Druckverfahren	Vorteile	Nachteile	Zellkompatibel?
Extrusionsbasiert	Druckgeschwindigkeit und -strukturen können in hohem Maße kontrolliert werden	Scherstress kann die Zellviabilität beeinträchtigen	Ja
Inkjet-basiert	Hohe Druckgeschwindigkeit Kompatibel mit biologischen Komponenten Geringe Kosten	Erfordert niedrigviskose Materialien	Ja
Stereolithographie (SLA)	Hohe Auflösung	Erfordert große Materialmengen Lange Verarbeitungszeit Lange Druckzeiten können die Zellviabilität beeinträchtigen	Ja
Laserbasiert	Kann mit viskosen Materialien verwendet werden Hochgenau	Vom Laser erzeugte Wärme kann Zellen beeinträchtigen	Ja
Schmelzschichtung (FDM, Fused Deposition Modeling)	Erzielt hochporöse Strukturen	Die Materialien müssen eine geschmolzene Phase aufweisen Wärme zum Schmelzen von Materialien, die nicht mit Zellen kompatibel sind Schwierige Herstellung komplexer Geometrien	Nein
Selektives Laser-Sintern (SLS)	Fähig zur Bildung komplexer Strukturen Erzielt bessere Bindung zwischen den einzelnen gedruckten Schichten	Vom Laser erzeugte Wärme ist nicht mit Zellen kompatibel	Nein

Neben dem Tintentyp kann die Bioprinting-Methode auch von der Endanwendung des gedruckten Konstrukts abhängen (Tabelle 3).

Anwendungen in der Gewebezüchtung

Tabelle 3. 3D-Bioprinting von Gewebekonstrukten.

Gewebemodell	Verwendete Zellen	Verwendeter Bioprinter	Verwendetes Biotintenmaterial	Referenz
Knorpel	Mesenchymale Stammzellen	HP® Deskjet 500 Drucker	PEG-Diacrylat	Inkjet-biogedruckte acrylierte Peptide und PEG-Hydrogel mit humanen mesenchymalen Stammzellen fördern eine robuste Knochen- und Knorpelbildung bei minimalem Verstopfen des Druckkopfs
	iPS-Zellen/Chondrozyten	3DDiscovery™	Alginat/ Nanocellulose	Knorpelgewebeentwicklung durch 3D-Bioprinting von iPS-Zellen in einer Nanozellulose/Alginat-Biotinte
	Chondrozyten	ITOP	PCL/Pluronic®	Ein 3D-Bioprinting-System zur Herstellung von Gewebekonstrukten im menschlichen Maßstab mit struktureller Integrität
Knochen	MC3T3-E1	Inhouse	Alginat/ Polyvinylalkohol/ Hydroxyapatit	Entwicklung eines neuartigen Alginat-Polyvinylalkohol-Hydroxylapatit-Hydrogels für das 3D-Bioprinting von Knochengewebegerüsten
	Mesenchymale Stammzellen	HP® Deskjet 500 Drucker	GelMA	Verbesserte Eigenschaften von Knochen- und Knorpelgewebe aus im 3D-Inkjet-Druckverfahren hergestellten menschlichen mesenchymalen Stammzellen durch gleichzeitige Ablagerung und Fotovernetzung in PEG-GelMA
Haut	Mesenchymale Stammzellen	Inhouse	Fibrin/Collagen I	Im Bioprinting beschleunigen aus Fruchtwasser gewonnene Stammzellen die Heilung großer Hautwunden
	Keratinozyten/ Fibroblasten	Inhouse	Kollagen I	Planung und Herstellung von menschlicher Haut durch dreidimensionales Bioprinting
Blutgefäß	HUVEC/HUVSMC/ Fibroblasten	Inhouse	Agarose	Gerüstfreie vaskuläre Gewebezüchtung mittels Bioprinting
Muskel	Aus Muskeln gewonnene Stammzellen	Inhouse	Fibrin	Durch Inkjet-Bioprinting erzeugte Mikroumgebungen lenken adulte Stammzellen räumlich in Richtung muskel- und knochenähnlicher Subpopulationen
Gehirn	Neurale Stammzellen	Inhouse	Polyurethan	3D-Bioprinting eines mit neuralen Stammzellen beladenen, thermoresponsiven, biologisch abbaubaren Polyurethan-Hydrogels und dessen Potenzial für die Reparatur des zentralen Nervensystems
Leber	iPS-Zellen	Nanoliter-Entnahmesystem	Alginat-RGD	Bioprinting humaner pluripotenter Stammzellen und ihre gezielte Differenzierung in hepatozytenähnliche Zellen zur Herstellung von Mini-Lebern in 3D
Lunge	A549/HUVEC	BioFactory™	EZM-Gel	Entwicklung einer In-vitro Luft-Blut-Barriere durch 3D-Bioprinting
Niere	Immortalisierte PTEC/Primäre RPTEC	Inhouse	Gelatine/Fibrin	Bioprinting von durch 3D konvolutierte proximale Nierentubuli auf durchlässigen Chips
Herz	HUVEC/Neonatale Kardiomyozyten	NovoGen MMX	Alginat/GelMA	Bioprinting von 3D-Mikrofasergerüsten für die Entwicklung von endothelialisiertem Myokard und Heart-on-a-Chip
	Mesenchymale Stammzellen/iPSC-abgeleitete Neuronen	3D-BioPlotter®	Graphen/ PLGA	Dreidimensionales Drucken von High Content-Graphengerüsten für elektronische und biomedizinische Anwendungen

Schlussfolgerung

Das 3D-Bioprinting ermöglicht die räumlich kontrollierte Platzierung von Zellen in einer definierten 3D-Mikroumgebung. Biotinten werden durch die Kombination aus Zellen und verschiedenen biokompatiblen Materialien gebildet, die anschließend in bestimmten Formen gedruckt werden, um gewebeähnliche 3D-Strukturen zu erzeugen. Durch die Kombination unseres Fachwissens in den Bereichen Werkstoffwissenschaft und Zellbiologie bieten wir eine Vielzahl Lösungen zur Vereinfachung des 3D-Bioprinting-Workflows.

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