Reinigung von Antikörpermarkierungsreaktionen mittels Amicon^®-Ultra-Filtern

Mit standardmäßigen Amicon^®-Ultra-Zentrifugenfiltern können innerhalb weniger Diafiltrationsrunden nicht integrierte Markierungen aus einer Antikörpermarkierungsreaktion effizient entfernt werden, ohne die Probe zu verdünnen. Halten Sie sich an das unten angegebene Protokoll, um unreagierte Fluoreszenzmarkierungen mittels Zentrifugeneinheiten für die Ultrafiltration zu entfernen.

Entfernen von unreagierten Fluoreszenzmarkierungen aus der Antikörper-Konjugat-Reaktion

1. 1 mg fluoreszenzmarkierte Antikörperlösung in 2 ml in zwei Amicon^®-Ultra-4-ml-10-kDa-MWCO-Einheiten geben und 10 Minuten lang bei 4.000 x g zentrifugieren.
2. Retentate (jeweils etwa 50 μl) in 2 ml mit Wasser erneut verdünnen und erneut zentrifugieren. Der Schritt wird zweimal wiederholt.
3. Nach jeder Zentrifugation die Retentatproben aufbewahren und für die SDS-PAGE-Analyse sowie die Quantifizierung mittels UV-Vis-Spektroskopie filtrieren.

Ergebnisse

Abbildung 1. Ergebnisse der SDS-PAGE-Gelelektrophorese von FITC-markiertem BSA vor und nach jedem der vier Diafiltratrionszyklen. Nicht integriertes FITC ist im Ausgangsmaterial und im ersten Filtrat sichtbar. Der Großteil der freien Markierung wurde nach einem Ultrafiltrationszyklus entfernt. Freies FITC ist nach den anschließenden Filtrationszyklen praktisch nicht mehr nachweisbar. Die Fluoreszenz-Messdaten in Abbildung 2 bestätigen dieses Ergebnis.

Abbildung 2. Das Signal von freiem FITC ist nach der ersten Ultrafiltration um etwa 80 % reduziert und nach den anschließenden Filtrationszyklen um etwa 98 %. Dies belegt die Eignung der Ultrafiltration als Alternative zur Gelfiltration bei der Reinigung von Proteinmarkierungsreaktionen.