Protokollleitfaden: Ganzkörperfärbung von Organoiden durch Immunfluoreszenzfärbung mit Antikörpern

Organoide haben komplexe dreidimensionale Strukturen und sind in EZM-Hydrogele eingebettet, wodurch ihre Charakterisierung erschwert wird. Die Immunfluoreszenzfärbung (IF) von Organoiden mit Antikörpern kann durchgeführt werden, um molekulare Marker in Bezug auf Zellverhalten, Proliferation, Differenzierung, Zellgesundheit und Identität sichtbar zu machen. Die Ganzkörper-Immunfärbung ist auf kleine Gewebestücke, die nicht geschnitten werden, ausgerichtet, und die Methoden der Färbung von Kryoschnitten in der Immunzytochemie (ICC) oder Immunhistochemie (IHC) sind sehr ähnlich. Die Ganzkörperfärbung von Organoiden kann in der antikörperbasierten Charakterisierung eingesetzt werden. In diesem Färbeprotokoll für Organoide werden die Methoden für die Fixierung, Permeabilisierung und Ganzkörperfärbung von Organoiden für die Analyse mittels immunfluoreszenter Konfokalmikroskopie beschrieben.

Abbildung 1. Immunfluoreszenz von Organoiden unter Verwendung von Antikörpern. Humane epitheliale Darm- und Lungenorganoide, angefärbt mit Antikörpern für Acetyl-α-Tubulin (A), α-Carbonanhydrase IV (B) und Sox-9 (AB5535) (C).

Färbeprotokoll für Organoide

1. Das Medium aus der Organoidkultur entfernen und vorsichtig 2X mit 1X PBS (D8537) waschen.
2. 30-40 organoide Matrigel-Kuppeln in einer 10-cm-Schale mit 15-20 ml 4 % PFA (1.00496) 30-60 Minuten bei Raumtemperatur fixieren.  
   Hinweis: Matrigel wird bei der Fixierung in PFA teilweise gelöst. 
3. Die Schale gelegentlich schwenken, um die Matrigel-Kuppeln zu lösen und die Organoide vom Matrigel zu befreien. 
   Hinweis: Nicht alle Organoide werden aus dem Matrigel gelöst.
4. 15-20 ml Fixiermittel aus der 10-cm-Schale in ein konisches 50-ml-Röhrchen gießen und die Organoide durch Schwerkraft auf den Boden des Röhrchens absinken lassen (~10-15 Minuten). 
5. Nachdem sich die Organoide durch die Schwerkraft am Boden des konischen 50-ml-Röhrchens abgesetzt haben, das Fixiermittel vorsichtig absaugen und dabei darauf achten, dass das Organoid-Pellet nicht mit abgesaugt wird. 
6. 15-20 ml 1X PBS (D8537) in die Schale aus Schritt 4 geben und 15-20 Minuten bei Raumtemperatur stehen lassen.
7. Nach Ablauf der 15-20 Minuten die Schale schwenken, um die Matrigel-Kuppeln weiter abzulösen, und 1X PBS (D8537) in das konische 50-ml-Röhrchen gießen, welches das Organoidpellet aus Schritt 5 enthält.
8. Die Schritte 5-7 drei weitere Male wiederholen.
9. Die Lösung absaugen, ohne das Organoidpellet zu verletzen, und 5 ml 1X PBS (D8537) hinzufügen, indem dieses auf die Seite des konischen 50-ml-Röhrchens, das das Organoidpellet enthält, gegeben und das Röhrchen geschwenkt wird, um das Organoidpellet zu resuspendieren.  
   Hinweis: Nicht mit einer Pipette auf- und abpipettieren. Dadurch werden die meisten Organoide zerbrochen.
10.  Die 5 ml 1X PBS (D8537), welche die Organoidklumpen enthalten, direkt in die 10-cm-Schale gießen, welche die nicht abgelösten Organoid-Matrigel-Kuppeln enthält.
11. Weitere 5 ml 1X PBS (D8537) in das konische 50-ml-Röhrchen geben, um so viele Organoidklumpen wie möglich aufzufangen, und direkt in die 10-cm-Schale mit den Organoiden gießen.
12. Bei späterer Verwendung die 10-cm-Schale mit Parafilm verschließen und im Kühlschrank bei 4 °C bis zu einem Monat aufbewahren. 
13. Wenn eine Immunfluoreszenzfärbung durchgeführt werden soll, die 10-cm-Schale mit den fixierten Organoiden aus dem Kühlschrank nehmen und diese unter einem Präpariermikroskop beobachten.
14. Die Spitze einer 1-ml-Pipette so abschneiden, dass die Öffnung groß genug ist, um die Organoide aufzusaugen, ohne sie abzuscheren oder zu zerbrechen.
15. Die Organoide (1–4) in einen 8-Well-Kammerobjektträger übertragen und die verbleibende 1X PBS (D8537) mit einer P-200-Pipette entnehmen.  Vermeiden, die Organoide aufzusaugen und diese durch die ungeschnittene P-200-Spitze zu scheren.
16. Die fixierten Organoide mit 0,5 ml Blockierungspuffer (5 % Pferdeserum + 0,5 % Triton X-100 in 1X PBS) über Nacht bei 4 °C oder 2-4 Stunden bei Raumtemperatur permeabilisieren.  Hinweis: Es wird empfohlen, das Serum der gleichen Spezies zu verwenden, von der auch der sekundäre Antikörper stammt.
17. Den Blockierungspuffer mit einer P-200-Pipette aus dem Kammerobjektträger, der die Organoide enthält, entnehmen.  Das Aufpipettieren der Organoide durch die P-200-Spitze vermeiden.
18. Primärantikörper (300-500 µl) oder direkt konjugierte Antikörper (300-500 µl) in Blockierungspuffer vorbereiten.
19. Verdünnte Antikörper in die entsprechend gekennzeichneten Wells mit den Organoiden geben.
20. Über Nacht bei 4 °C inkubieren lassen.
21. Am nächsten Tag 3X mit 1X PBS (D8537) jeweils 10-15 Minuten waschen. Hinweis: Bei Verwendung von direkt konjugierten Antikörpern sind die Proben bereit für die Darstellung auf einem Konfokalmikroskop.
22. Bei Verwendung von nicht konjugierten Primärantikörpern sekundäre Antikörper (300-500 µl) in Blockierungspuffer vorbereiten und zu den entsprechend markierten Proben geben
23. Ermöglicht die Färbung mit sekundären Antikörpern über Nacht bei 4 °C.
24. Am nächsten Tag 3X mit 1X PBS (D8537) jeweils 10-15 Minuten waschen.
25. Den Blockierungspuffer mit einer P-200-Pipette aus jedem Well entnehmen, das Organoide enthält.  Das Aufpipettieren der Organoide durch die P-200-Spitze vermeiden.
26. Die Kernfärbung durch Zugabe von DAPI (D9542) bei 5 µg/ml in 1X PBS (300–500 µl pro Probe) vorbereiten.
27. DAPI-Färbelösung zu jeder Probe geben und 15-20 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren lassen.
28. 3X mit 1X PBS (D8537) 10-15 Minuten pro Waschgang waschen.
29. Die Proben sind für die Aufnahme mit einem Konfokalmikroskop vorbereitet.