Impact de la méthode de purification GenElute™-E sur l'exactitude de la quantification de l'ADN et les procédés enzymatiques en aval
Ces méthodes de fixation-lavage-élution sont fastidieuses, car elles nécessitent de nombreuses étapes de lavage et de centrifugation. Le recours à plusieurs étapes de centrifugation peut provoquer un cisaillement important de l'ADN. En outre, les sels chaotropiques et d'autres contaminants peuvent facilement passer dans l'ADN ou l'ARN élué et compromettre la pureté et la quantification finales, ainsi que les procédés enzymatiques en aval tels que la PCR.
Nous avons étudié un nouveau système de purification des acides nucléiques à une seule centrifugation qui supprime les étapes de fixation et de lavage nécessitant de fortes concentrations de sel et d'éthanol. Les kits de purification d'ADN et d'ARN GenElute™-E utilisent une méthode de chromatographie négative reposant sur l'exclusion stérique pour séparer les grosses molécules d'acides nucléiques (ADN et ARN) des protéines, lipides et composants ioniques plus petits dans les échantillons de cellules, de tissus, de sang et autres (Figures 1 et 2).
Figure 1.Purification des acides nucléiques à l'aide de techniques de chromatographie négative (exclusion stérique).
Figure 2.Élution d'ADN purifié et rétention de protéines, lipides et autres molécules à l'aide d'un Kit d'ADN sanguin haut rendement GenElute™-E Single Spin à partir d'échantillons de sang de souris. A) Spectre d'absorbance de l'ADN génomique purifié (ligne rouge). B) Spectre d'absorbance du rétentat de la colonne à centrifuger GenElute™-E (ligne noire) superposé sur le spectre de l'ADN purifié (rouge). Le spectre du rétentat montre la présence de protéines et d'autres contaminants avec une densité optique à environ 280 nm ou ≤ 240 nm. Noter le changement d'échelle sur l'axe y.
Nous avons évalué l'impact de la méthode de purification des acides nucléiques sur les impuretés interférant avec la quantification et les procédés enzymatiques en aval. Aux fins de ces études de comparaison, l'ADN génomique a été préparé à l'aide de la technologie de purification GenElute™-E Single Spin ou d'une technologie de fixation-lavage-élution classique par centrifugation sur colonne de silice provenant d'un fournisseur X. La pureté des acides nucléiques a été évaluée à l'aide de trois méthodes :
- Spectrophotométrie UV (rapport de densité optique mesuré par les rapports A260 nm/280 nm et A260 nm/230 nm)
- Électrophorèse sur gel
- PCR quantitative (qPCR)
Les résultats indiquent que les systèmes de purification d'ADN et d'ARN GenElute™-E Single Spin permettent d'obtenir une plus grande pureté que les techniques actuelles de préparation par centrifugation sur colonne de silice. Cela entraîne une quantification plus précise et une réduction de l'interférence des contaminants dans les procédés enzymatiques en aval tels que la PCR.
Évaluation des impuretés introduites lors de la préparation des acides nucléiques
Interférences avec la quantification par spectrophotométrie UV
Les contaminants biologiques courants, tels que les protéines, les acides nucléiques fragmentés, l'ADNsb, l'ARN (si l'ADN est mesuré), les amorces et les sels chaotropiques issus des protocoles d'extraction et de purification peuvent mener à une surestimation de la concentration des acides nucléiques. Certaines de ces impuretés peuvent être mesurées à l'aide de la spectrophotométrie UV. Cette méthode consiste à faire passer une lumière UV à travers l'échantillon d'ADN ou d'ARN purifié. L'absorbance de l'échantillon est mesurée à différentes longueurs d'onde.
L'absorbance à 260 nm (A260) est utilisée pour mesurer les acides nucléiques. L'absorbance à 280 nm (A280) est utilisée pour mesurer les protéines contaminantes dans l'échantillon. Le rapport A260/A280 peut être utilisé pour estimer la pureté de l'échantillon par rapport aux protéines contaminantes. Un ADN de haute pureté présentera un rapport A260/A280 ≥ 1,8. Un rapport plus faible indiquera une contamination par une protéine dans la préparation finale.
L'absorbance à 230 nm (A230) peut être utilisée pour identifier la présence de contaminants chimiques tels que les sels chaotropiques. Le rapport A260/A230 doit idéalement être supérieur à 2,0 pour assurer une interférence chimique minimale lors des procédés enzymatiques tels que la PCR. Il est essentiel d'évaluer ce rapport lorsque des échantillons présentant une haute pureté sont requis.
Le spectre d'absorbance, le rapport A260/280 et le rapport A260/230 ont été évalués pour les systèmes de purification d'ADN et d'ARN GenElute™-E Single Spin à partir d'échantillons de sang. Les résultats ont été comparés à ceux obtenus lors de la purification par centrifugation sur colonne de silice des mêmes échantillons avec un produit concurrent (Figure 3 et Tableau 1). Les données suggèrent que les systèmes de purification GenElute™-E permettent d'obtenir une pureté de l'ADN génomique supérieure avec moins de contaminants biologiques et chimiques dans la préparation finale de l'échantillon par rapport aux méthodes de fixation-lavage-élution à base de silice.
Figure 3.Spectres d'absorption UV de l'ADN génomique préparé à partir d'un échantillon de sang à l'aide A) d'un kit de purification d'ADN par centrifugation sur colonne de silice provenant d'un fournisseur X ou B) d'un kit de purification d'ADN par chromatographie négative GenElute™-E Single Spin. Le graphique dans l'encart est mesuré à une concentration de 10× la fraction éluée. Des impuretés sont détectées uniquement dans les fractions d'élution sur silice. Les lignes noires correspondent au spectre de l'échantillon purifié à l'aide de la méthode indiquée et tiennent compte de l'impact des éventuels contaminants issus du procédé. Les lignes rouges correspondent au spectre de l'échantillon purifié, sans tenir compte des contaminants issus du procédé (utilisées comme contrôles de référence). Les lignes orange représentent le spectre de la méthode de purification sans utilisation d'un échantillon réel. Elles montrent l'impact des contaminants issus du procédé sur la lecture spectrophotométrique.
Impuretés de l'ADN cisaillé et des acides nucléiques de faible poids moléculaire évaluées par électrophorèse sur gel
La séparation par taille par électrophorèse permet d'évaluer visuellement et quantitativement la pureté de l'échantillon. L'ADN génomique de grande taille migre plus lentement que les fragments d'ADN et d'ARN de plus petite taille. Les bandes obtenues peuvent être observées ou quantifiées à l'aide d'un colorant fluorescent.
Les échantillons d'ADN purifié préparés à partir de tissu hépatique de souris à l'aide de kits de préparation par centrifugation sur colonne de silice (fournisseur X) ou par chromatographie négative reposant sur l'exclusion stérique (kits de purification d'ADN GenElute™-E Single Spin) ont été séparés sur un gel d'agarose. Le colorant SYBR Green a été utilisé pour la coloration des acides nucléiques. Afin de normaliser les résultats, la même masse d'ADN de chaque échantillon purifié a été chargée sur chaque piste du gel. La visualisation du gel d'agarose sur un transilluminateur a montré que la chromatographie négative (exclusion stérique) a permis d'obtenir des bandes uniques d'ADN génomique plus foncées que la méthode de purification à base de silice (Figure 4).
Les échantillons élués à l'aide de colonnes à centrifuger composées de membranes à base de silice ont présenté des bandes plus claires sur la partie inférieure du gel, ce qui reflète la présence de petites molécules contaminantes d'ARN ou d'ADN cisaillé dans la préparation finale. Étant donné que le chargement du gel a été normalisé par rapport à l'ADN présent dans l'échantillon (comme déterminé par l'absorbance à 260 nm), ces données suggèrent une surestimation du rendement de l'ADN génomique par cette méthode. En effet, les petites molécules d'acides nucléiques contaminantes contribuent également à la mesure de l'absorbance. La bande unique d'ADN de plus forte intensité obtenue à l'aide de la méthode de chromatographie négative (exclusion stérique) GenElute™-E suggère une pureté supérieure de l'ADN génomique provenant de ces échantillons de tissu. Les résultats ont été quantifiés à l'aide de méthodes de fluorimétrie (Figure 5).
Figure 4.Électrophorèse sur gel d'ADN génomique purifié provenant d'échantillons de tissu hépatique de souris. Le tissu de souris a été purifié à l'aide de méthodes de préparation par centrifugation sur colonne de silice (fournisseur X) ou par chromatographie négative reposant sur l'exclusion stérique (kits de purification d'ADN GenElute™-E Single Spin). Les échantillons ont été ajustés de sorte que la même quantité d'ADN soit chargée sur chaque piste du gel d'agarose. Les résultats suggèrent la présence d'ARN ou d'ADN cisaillé contaminant dans les échantillons purifiés à l'aide de la méthode à base de silice.
Figure 5.Calcul du rendement de l'ADN génomique (ADNg) et quantités d'ARN ou d'ADN cisaillé contaminant à partir d'échantillons de tissu hépatique de souris. Les échantillons ont été purifiés à l'aide de méthodes de préparation par centrifugation sur colonne de silice (fournisseur X) ou par chromatographie négative reposant sur l'exclusion stérique (kits de purification d'ADN GenElute™-E Single Spin). Les quantités d'ADN ont été calculées en quantifiant le signal de fluorescence émis par le colorant SYBR Green. Les résultats montrent des quantités faibles, mais significatives, d'ARN ou d'ADN cisaillé contaminant dans les échantillons préparés à l'aide de colonnes à centrifuger dans le cadre d'une purification à base de silice.
Interférences dans la qPCR
Les méthodes de purification à base de silice introduisent des sels dénaturants et des solvants organiques tels que l'éthanol dans l'échantillon faisant l'objet d'une purification. Ces contaminants peuvent être transférés dans les applications en aval et mener à l'inhibition des réactions enzymatiques. L'élimination de ces contaminants peut renforcer la sensibilité et la fiabilité des méthodes enzymatiques telles que la qPCR.
Pour évaluer la présence de contaminants inhibant les procédés enzymatiques, de l'ADN génomique provenant d'échantillons de rein de souris a été purifié à l'aide de chaque méthode de purification par centrifugation. Les échantillons finaux ont été utilisés dans le cadre d'expériences d'analyse de qPCR (Figure 6). Le gène correspondant à la bêta-actine a également été amplifié à titre de contrôle endogène. Les données montrent que les courbes d'amplification des échantillons purifiés à l'aide de silice sont décalées vers la droite par rapport aux échantillons préparés à l'aide de la méthode de purification par chromatographie négative (exclusion stérique) GenElute™-E. Cet élément suggère la présence de contaminants interférents ou un rendement inférieur à celui calculé dans les échantillons purifiés à l'aide de silice.
Figure 6.Analyse de qPCR pour la détection de la présence de contaminants interférents dans les préparations d'ADN génomique. A) Courbes d'amplification d'ADN génomique préparé à partir de tissu de rein de souris à l'aide d'un kit de préparation par centrifugation sur colonne de silice provenant d'un fournisseur X (courbes bleues) et d'un kit de préparation par chromatographie négative (exclusion stérique) GenElute™-E (courbes orange). Les courbes correspondant aux échantillons purifiés à l'aide de silice sont décalées vers la droite par rapport aux échantillons purifiés à l'aide de la technologie GenElute™-E. Cet élément suggère la présence de contaminants interférents ou une surestimation de la concentration initiale dans les échantillons préparés à l'aide de silice. B) Calcul de la valeur de Cq à l'aide du gène de la β-actine comme référence de contrôle endogène.
Conclusions
Les kits de purification d'ADN et d'ARN GenElute™-E Single Spin fournissent une méthode de chromatographie négative pratique basée sur l'exclusion stérique pour la purification des acides nucléiques. Ces kits offrent une alternative aux préparations par centrifugation sur colonne de silice classiques et permettent d'obtenir une pureté supérieure, comme le démontrent la spectrophotométrie UV, l'électrophorèse sur gel et la qPCR.
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