Purification de peptides sériques pour la spectrométrie de masse MALDI avec les filtres à centrifuger Amicon^® Ultra

Les biomarqueurs jouent un rôle essentiel dans la découverte de nouveaux médicaments et leur processus de développement. Ils donnent des informations cruciales sur les prédispositions génétiques, la progression des maladies et la réponse aux médicaments. Le sérum est l'une des principales sources de biomarqueurs protéiques putatifs. Un obstacle majeur à la découverte de nouveaux biomarqueurs est la présence de sels, de protéines et de lipides dans le plasma ou le sérum, qui interfère avec l'analyse des peptides par spectrométrie de masse. Divers protocoles peuvent être utilisés pour extraire des peptides à partir de tissus et de fluides corporels et les enrichir :

• Après précipitation des protéines, fractionnement par chromatographie en phase inverse sur résine C18
• Précipitation à l'acétonitrile des grosses protéines, tout en améliorant la solubilité des protéines et peptides de plus petite taille
• Ultrafiltration pour la préparation de fractions de faible poids moléculaire pour l'analyse de biomarqueurs^1–4

Associée à l'extraction en phase solide (SPE) sur résine C18, l'ultrafiltration est une méthode de purification pratique et efficace des peptides sériques. Cette approche permet d'obtenir plus de peptides pour l'analyse par spectrométrie de masse que la méthode par précipitation à l'acétonitrile. De plus, la préparation d'échantillons assistée par filtration (FASP pour "Filter-Aided Sample Preparation"), mise au point à l'origine avec nos filtres à centrifuger Microcon^®5, a récemment été optimisée pour une utilisation avec les filtres à centrifuger Amicon^® Ultra⁶.

L'un des avantages de la FASP est qu'il est possible d'échanger le tampon des échantillons et de concentrer les échantillons via plusieurs centrifugations sans risque d'assèchement/de précipitation. En outre, la FASP a été adaptée au format de plaque de 96 puits en utilisant nos plaques de filtration MultiScreen^®7. Cette adaptation au format à 96 puits permet de traiter rapidement les produits biologiques et offre des possibilités d'automatisation du procédé FASP à l'avenir.

Méthodes

I. Préparation des peptides sériques

1. Diluer 1 à 4 ml de sérum, de plasma ou de lysat cellulaire avec de l'acétonitrile à 10 % ou du tampon Tris-HCl 10-20 mM à pH 7,5 selon un rapport de 1/1.
2. Introduire l'échantillon dans des dispositifs à centrifuger Amicon^® Ultra-4 avec NMWCO de 10 kDa et centrifuger sur un rotor à godets mobiles pendant 15-30 minutes à 3000 × g.
3. Recueillir le filtrat
4. Si l'échantillon contient de l'acétonitrile, le placer dans un concentrateur sous vide pour évaporer le réactif ; dans le cas contraire, passer directement à l'étape 5.
5. Acidifier 10 µl de l'échantillon de filtrat avec 5 μl de TFA à 1 %.
6. En appliquant le protocole utilisant des pointes de pipette ZipTip^® μC18, dessaler le concentrat et purifier l'échantillon.
7. Éluer l'échantillon directement sur une cible de MALDI avec 2 μl de matrice constituée d'acide ∂-cyano-4-hydroxycinnamique (5 mg/ml dans de l'acétonitrile à 50 % avec 0,1 % de TFA). Remarque : si de l'acétonitrile a été ajouté au sérum avant la filtration, centrifuger brièvement les échantillons dans une centrifugeuse SpeedVac^® pour éliminer le solvant avant de procéder à la purification avec une pointe de pipette ZipTip^®.

II. Analyse des peptides par spectrométrie de masse en utilisant le filtrat d'ultrafiltres à centrifuger Amicon^® Ultra de 4 ml et 10 kDa

1. Acidifier les ultrafiltrats chargés de peptides issus des lysats cellulaires ou du sérum humain avec du TFA à 1 % et les concentrer à l'aide de pointes de pipette ZipTip^® μC18 ou de pointes de pipette ZipTip^® à échange de cations forts en suivant la procédure figurant dans le guide d'utilisation.
2. Recouvrir l'échantillon avec 1 μl de matrice constituée d'acide ∂-cyano-4-hydroxycinnamique (5 mg/ml dans de l'acétonitrile à 50 % avec 0,1 % de TFA) et l'analyser sur un spectromètre de masse MALDI.

III. Préparation des peptides sériques par précipitation à l'acétonitrile (échantillons témoins)

1. Diluer l'échantillon de sérum comme indiqué dans le protocole précédent (I 1.) en ajoutant de l'acétonitrile à 10 % selon un rapport de 1/1 (v/v).
2. Introduire l'échantillon dans un tube à centrifuger de 15 ml et le centrifuger pour faire précipiter les protéines.
3. Recueillir le surnageant et le placer dans une centrifugeuse SpeedVac pour évaporer l'acétonitrile.
4. Remettre en suspension l'échantillon dans du TFA à 0,1 %, le dessaler et le concentrer avec des pointes de pipette ZipTip^® μC18.
5. Effectuer une co-élution directement sur une cible de MALDI avec 2 μl de matrice constituée d'acide ∂-cyano-4-hydroxycinnamique (5 mg/ml dans de l'acétonitrile à 50 % avec 0,1 % de TFA).

Résultats

Les dispositifs à centrifuger Amicon^® Ultra-4 avec NMWCO de 30 kDa peuvent être utilisés pour préparer des peptides sériques en vue de leur analyse par spectrométrie de masse à haute résolution. Comparativement au sérum de rat non traité, la qualité des données est améliorée après élimination des grosses protéines par précipitation à l'acétonitrile (Figures 1A et B, ci-dessous). Le nombre et la qualité des pics de peptides détectés par MALDI-TOF ont significativement augmenté avec le sérum ultrafiltré (Figure 1B, ci-dessous).

La qualité des données a encore été accrue en intégrant de la chromatographie en phase inverse au protocole de préparation des échantillons, soit seule, soit en association avec une précipitation à l'acétonitrile et une ultracentrifugation (Figure 2, ci-dessous). Ici, la pointe de pipette ZipTip^® μC18 constitue un outil pratique et efficace pour préparer les échantillons à l'échelle micro avant la spectrométrie de masse. Les trois méthodes de préparation d'échantillons ont donné le signal, le rapport signal sur bruit et le nombre de peptides détectés maximum (Figure 2D, ci-dessous).

Cette approche peut directement être utilisée en association avec les pointes de pipette ZipTip^® μC18 pour identifier les peptides par MS/MS, ou comme étape préalable à un autre enrichissement sur une surface selon des méthodes de SELDI-TOF. Ces protocoles peuvent s'appliquer à d'autres marqueurs de faible poids moléculaire, tels que les médicaments et leurs métabolites.