Élimination des impuretés après les réactions de marquage par anticorps à l'aide de filtres Amicon^® Ultra

Avec les filtres à centrifuger Amicon^® Ultra standards, il est possible d'éliminer efficacement d'une réaction de marquage par anticorps les marqueurs non intégrés à l'aide de quelques étapes de diafiltration, et ce sans diluer l'échantillon. Suivez le protocole ci-dessous pour éliminer les marqueurs fluorescents n'ayant pas réagi à l'aide de dispositifs d'ultrafiltration par centrifugation.

Élimination du marqueur fluorescent n'ayant pas réagi après une réaction de conjugaison d'anticorps

1. Dans deux dispositifs Amicon^® Ultra de 4 ml avec un MWCO de 10 kDa, introduire 1 mg de solution d'anticorps marqué par fluorescence dans 2 ml et centrifuger à 4 000 × g pendant 10 minutes.
2. Diluer à nouveau les rétentats (d'environ 50 µl chacun) avec de l'eau jusqu'à atteindre un volume de 2 ml et centrifuger de nouveau. Répéter cette étape deux fois.
3. Après chaque centrifugation, prélever des échantillons du rétentat et les filtrer en vue d'une analyse SDS-PAGE et d'une quantification par spectroscopie UV-Vis.

Résultats

Figure 1. Gel de SDS-PAGE d'une BSA marquée au FITC avant et après chacun des quatre cycles de diafiltration. Le FITC non incorporé est visible dans le produit de départ et dans le premier filtrat. La majorité du marqueur libre est éliminée après un cycle d'ultrafiltration ; le FITC libre est pratiquement indétectable après plusieurs cycles de filtration. Les données de mesure de la fluorescence de la Figure 2 confirment ce résultat.

Figure 2. Le signal du FITC libre est réduit d'environ 80 % après la première ultrafiltration et son élimination atteint 98 % après les cycles de filtration suivants. Cela montre la viabilité de l'ultrafiltration comme alternative à la filtration sur gel pour éliminer les impuretés après les réactions de marquage des protéines.