Présentation de l'électrophorèse SDS-PAGE (séparation des protéines selon leur taille)

Les gels de polyacrylamide sont formés par la réaction d'un acrylamide et d'un bis-acrylamide (N,N'-méthylènebisacrylamide) qui donne une matrice de gel hautement réticulée. Le gel se comporte comme un tamis à travers lequel les protéines se déplacent sous l'effet d'un champ électrique. Puisque les protéines possèdent une charge globale positive ou négative, une molécule protéique peut se déplacer vers le point isoélectrique où elle n'a aucune charge nette. En dénaturant les protéines et en leur conférant une charge négative uniforme, il est possible de les séparer en fonction de leur taille à mesure qu'elles migrent vers l'électrode positive.

Figure 1. Électrophorèse SDS-PAGE d'échantillons de protéines avec le marqueur protéique ColorBurst™ (C1992)

Protocole

Matériel et réactifs nécessaires

• Cuve d'électrophorèse verticale avec alimentation électrique, plaques de verre, séparateurs et peignes

Réactifs nécessaires	Composants du réactif	Réf. produit
Solution d'acrylamide/bis-acrylamide	Acrylamide 29,2 g Bis-acrylamide 0,8 g	01696 M7279
Tampons de coulage de gel	Tris-HCl 1,5 M, pH 8,8 (pour la préparation du gel de séparation) : Dissoudre 18,15 g de base Tris dans 80 ml d'eau distillée. Ajuster le pH à 8,8 avec du HCl 6 N. Compléter avec de l'eau distillée jusqu'à un volume final de 100 ml. Tris-HCl 0,5 M, pH 6,8 (pour la préparation du gel de concentration) : Dissoudre 6 g de base Tris dans 80 ml d'eau distillée. Ajuster le pH à 6,8 avec du HCl 6 N. Compléter avec de l'eau distillée jusqu'à un volume final de 100 ml.	93362
Tampon de charge selon Laemmli concentré 2 ×	Bleu de bromophénol 0,004 % 2-mercaptoéthanol 10 % Glycérol 20 % SDS 4 % Tris-HCl 0,125 M	B5525 M3148 G5516 L3771 93362
Tampon de migration concentré 10 ×	Tris-HCl 25 mM Glycine 200 mM SDS 0,1 % (p/v)	93362 G8898 L3771
SDS à 10 %	SDS	L3771
Persulfate d'ammonium à 10 %	Persulfate d'ammonium	A3678
TEMED	TEMED	T9281

REMARQUE : L'acrylamide et le bis-acrylamide sont neurotoxiques. Toutes les opérations doivent être réalisées avec des gants non poudrés.

Préparation du gel

• Nettoyer les plaques de verre et les séparateurs de l'unité de coulage à l'eau désionisée et à l'éthanol.
• Assembler les plaques et les séparateurs sur une surface plane et stable.
• Préparer la solution de gel de séparation en utilisant les volumes suivants (pour 10 ml), selon le pourcentage de gel requis.

% de gel	Eau (ml)	Acrylamide à 30 % (ml)	Tris-HCl 1,5 M, pH 8,8 (ml)	SDS à 10 % (µl)	APS à 10 % (µl)	TEMED* (µl)
8 %	4,6	2,6	2,6	100	100	10
10 %	3,8	3,4	2,6	100	100	10
12 %	3,2	4,0	2,6	100	100	10
15 %	2,2	5,0	2,6	100	100	10
* Le TEMED doit être ajouté en dernier

• Verser la solution de gel entre les plaques assemblées avec les séparateurs. Pour que la surface du gel de séparation reste bien lisse et horizontale, la recouvrir d'eau ou d'isopropanol (I9516).
  
• Laisser le gel se solidifier à température ambiante pendant 20 à 30 minutes.
  
• Préparer la solution de gel de concentration en utilisant les volumes suivants (pour 10 ml).
  

% de gel	Eau (ml)	Acrylamide à 30 % (ml)	Tris-HCl 0,5 M, pH 6,8 (ml)	SDS à 10 % (µl)	APS à 10 % (µl)	TEMED* (µl)
5 %	5,86	1,34	2,6	100	100	10

* Le TEMED doit être ajouté en dernier

• Jeter l'eau ou l'isopropanol couvrant le gel de séparation.
• Ajouter la solution de gel de concentration à 5 % jusqu'à débordement. Insérer immédiatement le peigne en veillant à ne pas piéger de bulles d'air dans le gel ou à proximité des puits.
• Laisser le gel se solidifier à température ambiante pendant 20 à 30 minutes.
  

Préparation des échantillons

• À un volume d'échantillon de protéines (lysat cellulaire ou tissulaire) donné, ajouter le même volume de tampon de charge.
  
• Porter le mélange à ébullition à 95 °C pendant 5 minutes. Centrifuger à 16 000 × g pendant 5 minutes.
  
• Ces échantillons peuvent être conservés à -20 °C ou utilisés en électrophorèse sur gel.

Coloration du gel

Coloration au bleu de Coomassie : La coloration des gels de protéines au bleu brillant de Coomassie R-250 est une technique courante pour la visualisation des protéines séparées par SDS-PAGE. Elle est très sensible et adaptée à une conservation des gels à long terme.

Réactifs nécessaires

• Solution de fixation pour gel (500 ml)
  
       Méthanol (M3641) 250 ml
       Acide acétique glacial (695092) 50 ml
       Eau 200 ml
  
  
• Solution de Coomassie
  
       CBB R-250 (B6529) 0,1 %
       Méthanol (M3641) 40 %
       Acide acétique glacial (695092) 10 %
       Filtrer la solution colorante à travers un papier filtre Whatman n° 1.
  
  
• Solution de décoloration
  
       Méthanol (M3641) 50 ml
       Acide acétique glacial (695092) 35 ml
  
  
• Solution de conservation de gel
  
       Acide acétique glacial (695092) 25 ml
       Eau 475 ml

Protocole

• Après l'électrophorèse, placer le gel dans un plateau en plastique contenant la solution de fixation pour gel. Placer le plateau sur un agitateur basculant et fixer les protéines pendant 2 heures.
  
• Éliminer la solution de fixation pour gel et ajouter la solution de Coomassie.  Placer le plateau sur un agitateur basculant et colorer le gel pendant 2 à 4 heures.
  
• Après l'étape de coloration, laver le gel plusieurs fois à l'eau distillée afin d'éliminer le surplus de colorant.
  
• Ajouter la solution de décoloration. Placer le plateau sur un agitateur basculant et décolorer le gel pendant environ 4 heures jusqu'à l'apparition de bandes bleu clair sur fond clair.
  
• Les gels décolorés peuvent être conservés dans la solution de conservation de gel et photographiés selon les besoins.

Coloration au nitrate d'argent

Nous proposons un kit de détection des protéines ultrasensible par coloration au nitrate d'argent, adapté aux gels de SDS-PAGE. Les réactifs suivants sont également nécessaires :

• Solution de fixation
  
       Éthanol (E7023) 50 ml
       Acide acétique 10 ml
       Eau 40 ml
  
  
• Solution d'éthanol à 30 % (E7023)

Protocole

• Après la séparation électrophorétique, plonger le gel dans la solution de fixation pendant 40 minutes. Une immersion d'une nuit dans le fixateur donnera un fond plus clair.
  
• Éliminer la solution de fixation et laver le gel avec la solution d'éthanol à 30 % pendant 10 minutes, puis à l'eau ultra pure pendant 10 minutes.
  
• Transvaser l'eau et incuber le gel dans la solution de sensibilisation pendant 10 minutes.
  
• Retirer la solution de sensibilisation et laver le gel deux fois à l'eau, pendant 10 minutes à chaque fois.
  
• Transvaser l'eau et plonger le gel dans la solution de nitrate d'argent pendant 10 minutes.
  
• Transvaser la solution de nitrate d'argent et laver le gel à l'eau pendant 1,5 minute.
  
• Jeter l'eau et plonger le gel dans la solution de révélation pendant 3 à 7 minutes.
  
• Ajouter 5 ml de solution d'arrêt à la solution de révélation et incuber pendant 5 minutes. Éliminer le mélange solution de révélation/solution d'arrêt et laver le gel à l'eau ultra pure pendant 15 minutes.
  
• Le gel peut être photographié ; il peut également être conservé dans de l'eau ultra pure fraîche.

Pour une double coloration, colorer le gel au CBB R-250, puis au nitrate d'argent conformément au protocole décrit ci-dessus.

Colorants fluorescents : Nous proposons des colorants SYPRO et Lucy fluorescents pour l'électrophorèse des protéines. Les gels peuvent être plongés dans le colorant fluorescent dans l'obscurité ; le gel peut également être mélangé au tampon de cathode pendant l'électrophorèse.

Le protocole de coloration dépend du colorant utilisé :

• Colorant SYPRO^® Ruby pour gel d'électrophorèse de protéines (PDF)
  
• Solution LUCY^® 506 (PDF)
  

Coloration réversible du gel

Les colorants réversibles permettent de réaliser un western blotting des protéines après SDS-PAGE.

Coloration R-PROB : R-PROB est un colorant spécial qui permet de détecter les protéines présentes sur des gels PAGE et des membranes de western blotting.

Réactifs nécessaires :

• Kit de détection des protéines réversible pour membranes et gels de polyacrylamide (RPROB)
  
• Solution de fixation (F7264)
  
• Acide acétique à 10 %
  
• EDTA 50 mM

Protocole

• Après l'électrophorèse, plonger les gels dans la solution de fixation pendant 20 minutes. Répéter cette étape deux fois.
  
• Rincer le gel deux fois à l'eau, pendant 30 minutes à chaque fois.
  
• Incuber le gel dans la solution de coloration pendant 20 à 40 minutes sous agitation modérée.
  
• Éliminer le surplus de colorant par lavage à l'acide acétique à 10 %.
  
• Pour la décoloration, laver le gel à l'EDTA, puis le laver deux fois à l'eau ou avec la solution de fixation, pendant 15 minutes à chaque fois.

Coloration au cuivre : Pour confirmer la migration et la séparation des protéines, le gel peut être coloré avec un colorant réversible comme le dichlorure de cuivre (CuCl₂).

Réactifs nécessaires

• Solution de CuCl₂ 0,3 M
  
• Solution de Tris 0,25 M et d'EDTA 0,25 M

Protocole

• Après l'électrophorèse, rincer les gels à l'eau distillée pendant 30 minutes maximum.
  
• Plonger le gel dans la solution de CuCl₂ 0,3 M pendant 10 minutes.
  
• Rincer à l'eau désionisée.
  
• Les protéines forment des zones claires sur un fond bleu.
  
• Pour une décoloration complète du gel en vue d'un western blotting, laver plusieurs fois les gels colorés dans la solution de Tris 0,25 M et d'EDTA 0,25 M (pH 9).
  
• Transférer le gel décoloré dans le tampon de transfert avant de procéder à la mise en place du transfert.

Figure 2. Système de transfert sur membrane et d'électrophorèse verticale

Si un transfert des protéines doit être réalisé après l'électrophorèse, suivre le protocole décrit ici.

Référence

1. Sambrook J, Fritsch T, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.