Croissance cellulaire et maintenance des cellules
La culture cellulaire est une technique fondamentale utilisée en recherche en sciences de la vie pour établir des modèles biologiques pertinents ou pour produire des protéines recombinantes, des particules virales ou des thérapies biologiques. La croissance et la maintenance des cellules cultivées du type cellules de bactérie, de levure ou de mammifère sont assurées dans un poste de sécurité microbiologique (souvent appelé hotte de culture cellulaire ou tissulaire) à l'aide d'une technique stérile appropriée pour empêcher toute contamination microbienne ou chimique.
Types de culture cellulaire
Deux des principales approches de la culture de cellules de mammifères sont la culture primaire et la culture en continu. Les cultures primaires sont directement issues de tissus humains ou animaux ; leur durée de vie en culture est limitée par la sénescence cellulaire. Les cultures en continu sont considérées comme "immortelles", car elles sont souvent tirées de tissus cancéreux de patients. Les lignées cellulaires peuvent aussi être créées par immortalisation de cellules et peuvent subir des propagations ou des passages en série durant de nombreux cycles de division cellulaire, voire indéfiniment.
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Les cellules peuvent être cultivées en suspension ou sous forme d'une monocouche en 2D qui se fixe au flacon ou à la plaque multipuits de culture tissulaire. La méthode de culture dépend du tissu dont sont originaires les cellules ; les cellules issues du sang se multiplient généralement en suspension, tandis que celles provenant de tissus solides se développent habituellement en monocouches.
Les modèles de culture cellulaire en 3D (organoïdes et sphéroïdes) sont en général reconnus pour mieux imiter l'environnement in vivo des cellules que les surfaces en 2D. Les sphéroïdes sont souvent formés à partir de lignées de cellules cancéreuses ou de biopsies tumorales (xénogreffes issues de patients, ou PDX pour "patient-derived xenograft") et se présentent sous forme d'agrégats flottants de cellules dans des plaques à adhérence ultra faible. Les organoïdes, quand à eux, sont communément issus de cellules souches tissulaires incluses, puis différenciées dans une matrice d'hydrogel ECM.
Phases de croissance cellulaire
L'assurance d'une croissance adéquate des cellules est essentielle à la collecte de données exactes dans les études de culture cellulaire. Les cellules peuvent être dénombrées à l'aide d'un hémocytomètre ou d'un compteur de cellules automatisé, qui permet des dénombrements plus précis.
La croissance des cellules en culture se déroule généralement en quatre phases :
- Phase de latence – Les cellules s'ajustent aux conditions de culture et aucune division n'a lieu.
- Phase de croissance logarithmique – Les cellules se divisent activement, il s'agit donc du meilleur stade pour évaluer la croissance d'une population ou recueillir des données. Le stade tardif de la phase de croissance logarithmique est le meilleur moment pour le passage (sous-culture) des cellules.
- Phase stationnaire (plateau) – La croissance se ralentit au fur et à mesure que les cellules se rapprochent d'une confluence de 100 %. C'est à ce moment que les cellules sont le plus sensibles au stress ou à la détérioration, car les déchets cellulaires s'accumulent et les ressources s'appauvrissent.
- Phase de déclin – La population de cellules vivantes décline, la mort cellulaire prend le pas.
Milieux, suppléments et réactifs de culture cellulaire
Les cellules en culture ont besoin d'une source de nutriments pour croître. Les milieux de culture pour cellules de mammifères doivent maintenir un pH physiologique tout en apportant un niveau équilibré de sels, glucides, acides aminés, vitamines, acides gras et lipides, protéines et peptides, oligo-éléments et facteurs de croissance. Le sérum de veau fœtal (FBS) est le supplément de croissance le plus couramment utilisé pour la culture des cellules de mammifères, car il contient nombre de ces nutriments cellulaires essentiels, et la preuve a été faite qu'il soutient la croissance des cellules et des tissus en culture. Pour les applications nécessitant des milieux définis ou une teneur réduite en substances d'origine animale, les formulations de milieux sans xénocomposé proposent des formulations de composition connue, dépourvues de substances d'origine animale.
Comme les milieux et suppléments apportent souvent de riches nutriments favorisant la croissance des microbes opportunistes, la réussite d'une culture cellulaire passe par une technique aseptique et une observation régulière, pour garantir l'absence de contaminants susceptibles de provoquer la mort des cellules ou de perturber la croissance en s'éloignant des conditions in vivo. Pour les contaminants microbiens courants que l'on ne peut observer au microscope, un dépistage de routine avec des réactifs de détection des mycoplasmes permet de protéger les cultures et les environnements de propagation pour tissus.
Les cultures de levures, telles que S. cerevisiae et P. pastoris (Pichia), sont couramment utilisées en recherche pour l'expression des protéines recombinantes et les études sur la fonction des gènes. Les nutriments critiques habituellement présents dans une formulation de milieu de culture pour levures sont la peptone, l'extrait de levure, et le dextrose ou le glucose.
Trucs et astuces pour le repiquage
Le repiquage des cellules est une étape fondamentale de la culture cellulaire classique pour préserver la santé cellulaire et optimiser la croissance des cellules. Ce tutoriel explique le processus de repiquage, notamment l'importance de la confluence et de la densité cellulaire. Le protocole de repiquage des cellules implique des étapes comme la surveillance et le comptage des cellules, la trypsinisation ou dissociation des cellules, et le ré-ensemencement des cellules dans un nouveau récipient de culture.
Environnements et matériel de culture cellulaire
Les cellules cultivées sont multipliées et manipulées avec du matériel en plastique stérile à usage unique, notamment des flacons et des plaques multipuits de culture tissulaire, des pipettes sérologiques, des unités de filtration stérile pour flacon et des filtres pour seringue stériles. Les flacons et plaques de culture tissulaire en plastique sont généralement traités pour obtenir une surface hydrophile et ainsi faciliter la fixation des cellules adhérentes. Alternatives aux surfaces en 2D, les plaques à base de membranes microporeuses offrent un environnement de croissance plus proche des conditions physiologiques pour les essais complexes, tels que ceux portant sur la migration cellulaire, la communication entre cellules et la polarisation des cellules.
Les cellules en culture doivent être maintenues à une température et dans un environnement gazeux qui permettent de recréer les conditions de l'organisme dont elles sont issues. Le matériel de culture contenant les cellules et les milieux est habituellement maintenu dans des appareils d'incubation assurant une régulation précise de la température et des mélanges gazeux. Cependant, ce sont les petits systèmes d'incubation de paillasse, employant de la microfluidique et facilitant l'imagerie des cellules en culture ininterrompue, qui fournissent les environnements les plus authentiques pour les modèles prédictifs in vitro.
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