Perguntas frequentes sobre os kits de purificação de DNA e RNA com centrifugação única GenElute™-E
A lista a seguir contém perguntas frequentes relacionadas aos kits de purificação de DNA e RNA com centrifugação única GenElute™-E.
O que há de tão especial nas enzimas SmartLyse?
As enzimas SmartLyse™ direcionadas reduzem o tempo de lise e permitem um fluxo de trabalho mais eficiente, aliviando o cientista do manuseio maçante de tubos ao eliminar as etapas de ligação e lavagem.
Geralmente, ao usar colunas de sílica para purificação, o cientista pode eluir com um volume menor para obter uma amostra mais concentrada ou eluir duas vezes para obter um rendimento maior. Qual é a diferença dessa tecnologia?
Ao eluir com um volume menor usando sílica, é possível obter uma concentração maior. Entretanto, os sais residuais e o etanol necessários para ligar e lavar a amostra também estarão presentes em uma concentração mais alta. Com a cromatografia negativa, o volume que você carrega é essencialmente o volume que você recupera (normalmente ~80-100 µl), que geralmente é mais concentrado do que as amostras de ácido nucleico isoladas em sílica. Com a sílica, uma segunda eluição geralmente libera mais contaminantes do processo e ácido nucleico fragmentado menor, o que pode levar a uma quantificação imprecisa e resultar em uma superestimativa do rendimento.
Como a tecnologia GenElute-E melhora a precisão da quantificação de ácidos nucleicos?
Não há contaminantes de processo introduzidos quando se usa a cromatografia negativa para purificação, e mais ácidos nucleicos de comprimento total são recuperados pela redução das etapas de centrifugação. Isso melhora a precisão da quantificação que leva às aplicações de jusante e elimina os contaminantes que podem interferir na própria aplicação downstream (a jusante), tornando os experimentos mais robustos.
Que outras vantagens o GenElute-E oferece aos pesquisadores?
A eliminação das etapas de aglutinação e lavagem é uma abordagem mais sustentável para o isolamento de ácidos nucleicos, reduzindo a quantidade de tubos plásticos e resíduos químicos de fluxo. Isso torna o GenElute™-E uma opção química sustentável e ecológica que é mais benéfica para todos.
Estou usando uma enzima de amplificação (polimerase) complicada. Essa tecnologia elimina os íons Mg+2 das minhas preparações?
Elimina! A tecnologia de purificação por centrifugação única GenElute™-E esgota os íons, permitindo reações enzimáticas downstream (a jusante) mais robustas ao garantir que a concentração dos componentes do tampão enzimático seja melhor otimizada sem nenhum inibidor “surpresa”.
Qual é a composição do tampão de lise e do tampão de limpeza após o fluxo através da resina?
A presença de EDTA, SDS ou excesso de sal pode afetar minha reação de PCR/sequenciamento...
As informações sobre o tampão de lise são exclusivas, mas podemos dizer que ele é livre de sais caotrópicos. As resinas são resinas de dessalinização, de modo que o EDTA, o SDS e os sais são eliminados. Essa é a beleza da tecnologia!
A tecnologia introduz algum viés na amostra?
O GenElute™-E não introduz os vieses que algumas tecnologias de “ligar-lavar-eluir” podem acrescentar porque a tecnologia separa por tamanho, em vez de separar pelo que se liga e pelo que é liberado.
Sabemos qual é a estabilidade do DNA purificado durante vários ciclos de congelamento e descongelamento?
Isso flutuará devido à variabilidade da amostra (coleta da amostra, concentração, comprimento do fragmento, sequência [conteúdo de GC], armazenamento antes do isolamento, etc.). No entanto, a amostra é trocada por um tampão de armazenamento padrão que está incluído no kit (1X TE).
Em primeiro lugar, com relação ao cisalhamento e à redução do dano por cisalhamento associado a várias rotações em uma coluna de spin, isso é relevante para o RNA? Em segundo lugar, como a coluna de cromatografia negativa exclui grandes proteínas/glicoproteínas carregadas negativamente quando se deseja extrair ácido nucleico (especificamente, RNA)?
- As extrações de RNA são propensas à degradação de fragmentos, geralmente devido a digestões enzimáticas dentro da amostra (RNases). Portanto, é importante isolar o ácido nucleico dessas enzimas o mais rápido possível. Em um procedimento típico de preparação com centrifugação de ligar-lavar-eluir, o cisalhamento da amostra ocorre devido a várias etapas de centrifugação, bem como ao processo de ligação e liberação da biomolécula de uma membrana ou grânulo/resina. A remoção dessas variáveis de processo do fluxo de trabalho do isolamento de RNA permite maior controle da qualidade do fragmento final da amostra. No entanto, algumas aplicações downstream (a jusante) não precisam desse nível de controle, pois são menos sensíveis a essas degradações. Os controles são úteis, especialmente para amostras com rendimentos mais baixos, e podem ajudar na solução de problemas se os processos downstream (a jusante) falharem.
- Há muitos métodos de cromatografia que aproveitam as diferenças nas biomoléculas para a separação, como íons/carga para sílica. A “cromatografia negativa” funciona por exclusão de tamanho, permitindo que os produtos de maior peso molecular sejam coletados primeiro. Podemos entender perfeitamente o fato de o intuitivo equiparar nosso uso da palavra “negativo” à carga! As proteínas, que são digeridas pelas enzimas SmartLyse™, fluirão mais lentamente pela matriz de resina do que as moléculas de RNA e permanecerão dentro da coluna após a centrifugação. Truque rápido: Se quiser coletar esses fragmentos de proteína digeridos junto com outras biomoléculas de peso molecular menor, você pode girar a coluna após a purificação em uma velocidade mais alta para coletar a fração de movimento mais lento.
O kit com centrifugação única GenElute™-E para limpeza de DNA funcionará para extrações em gel?
O kit com centrifugação única GenElute™-E para limpeza de DNA não é recomendado para essa aplicação, pois a matriz de gel tem o potencial de entupir a resina de purificação.
O DNA extraído é compatível com todos as aplicações downstream (a jusante) (por exemplo, sequenciamento)?
Os kits de purificação com centrifugação única GenElute™-E funcionam com todas as aplicações nucleicas downstream (a jusante) relevantes.
É possível reutilizar uma coluna de centrifugação para a mesma amostra se o volume da amostra for superior a 100 µl? Além disso, você pode aumentar o volume do tampão de lise para amostras acima de 20 mg?
Infelizmente, as colunas não podem ser reutilizadas. Se a amostra exceder 100 µl, será necessária uma nova coluna. Entretanto, as colunas de centrifugação estão disponíveis separadamente como kits de limpeza com centrifugação simples GenElute™-E. A escala para a carga da amostra é baseada nas limitações da enzima protease, portanto, elas precisariam ser dimensionadas e podem ser otimizadas para a amostra. No entanto, o volume carregado é o fator limitante.
Qual é a força g máxima que posso usar na etapa de lise?
Essa etapa tem o objetivo de limpar a amostra com um sal facilmente esgotável. As velocidades máximas de centrifugação de todas as microcentrífugas comuns estão todas dentro da faixa de execução dessa etapa sem fracionar o ácido nucleico no pellet.
Há alguma recomendação de RPM para o agitador, uma vez que ele indica apenas “máximo”?
Amostras diferentes exigem velocidades de agitação diferentes para manter a amostra em suspensão. O aumento do tempo de lise e a adição de uma etapa de vórtex durante as incubações podem melhorar a lise de determinados tipos de amostras.
Por que existem duas incubações de temperatura diferentes (60 °C e 80 °C) para alguns kits de purificação com centrifugação única GenElute™-E?
A incubação inicial é a temperatura ideal para as enzimas SmartLyse™. A segunda incubação é uma etapa de inativação por calor e também liberará quaisquer proteínas parcialmente digeridas do ácido nucleico.
Preciso de pontas de pipeta específicas para introduzir minha amostra na coluna?
Se estiver usando o protocolo do perfurador de tampa, não é recomendável usar uma ponta de furo largo. Se for necessária uma ponta de furo largo, não tente usar o protocolo do perfurador de tampa. Normalmente, durante a etapa de limpeza, as partículas que poderiam obstruir a ponteira são aglomeradas e o sobrenadante é carregado. Entretanto, se uma amostra tiver um alto teor de ácido nucleico, ela poderá ser muito viscosa para usar uma ponteira de carregamento de gel. Recomenda-se o uso de ponteiras de pipeta padrão ao executar o protocolo do perfurador de tampa.
Por que não consigo inserir a ponteira da pipeta na diagonal da tampa? O leito de resina está na lateral da coluna?
Devido às forças centrífugas, muitas vezes é observada uma inclinação com a resina na coluna preparada. Recomenda-se carregar a amostra verticalmente para que a amostra se disperse uniformemente pela resina e não fique concentrada em um lado.
O que significa 5 segundos para o carregamento de amostras? São 5 seg/µl ou 5 seg/100 µl de amostra?
Pipete a amostra lenta e uniformemente para não perturbar muito as esferas de resina embaladas.
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