Limpeza das reações de marcação de anticorpos utilizando os Amicon^® Ultra Filters

Utilizando um Amicon^® Ultra centrifugal filter padrão, algumas rondas de diafiltração podem remover eficazmente o rótulo não incorporado de uma reação de rotulagem de anticorpos sem diluir a amostra. Use o protocolo abaixo para remover etiquetas fluorescentes não reagidos usando dispositivos de ultrafiltração centrífugos.

Remoção de rótulo fluorescente não reagido da reação de conjugação de anticorpos

1. Carregar 1 mg de solução de anticorpo com marcação fluorescente em 2 ml em dois dispositivos Amicon^® Ultra-4 mL 10 kDa MWCO e centrifugar a 4.000 x g durante 10 minutos.
2. Rediluir retentados (cerca de 50 μL cada) a 2 ml com água e centrifugar novamente. Repita esta etapa duas vezes.
3. Após cada centrifugação, salvar amostras do retentado e filtrado para análise e quantificação de SDS-PAGE usando espetroscopia UV-Vis.

Resultados

Figura 1. Mostra o gel SDS-PAGE da BSA rotulada como FITC antes e depois de cada um dos quatro ciclos de diafiltração. O FITC não incorporado é visível no material de partida e no primeiro filtrado. A maioria da etiqueta livre é removida após um ciclo de ultrafiltração; FITC livre é praticamente indetectável após ciclos de filtração subsequentes. Os dados de medição de fluorescência na Figura 2 confirmam este resultado.

Figura 2. O sinal FITC gratuito é reduzido em cerca de 80% após a primeira ultrafiltração e reduzido ainda mais para 98% de remoção após ciclos de filtração subsequentes. Isso demonstra a viabilidade da ultrafiltração como uma alternativa à filtração de gel para limpeza de reações de rotulagem de proteínas.