Moldagem manual de géis para PAGE e SDS-PAGE com o uso dos kits de moldagem de géis bis-tris mPAGE® TurboMix
Eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE)
A eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) é uma técnica fundamental usada para separar proteínas e outras macromoléculas por sua mobilidade eletroforética. Os géis de poliacrilamida são formados pela polimerização de monômeros de acrilamida e moléculas reticulantes de bis-acrilamida. Juntas, a acrilamida e a bis-acrilamida formam poros que possibilitam a migração de proteínas.
Géis de poliacrilamida são compostos por duas partes: uma parte de empilhamento e uma parte de resolução. A parte de empilhamento do gel é uma acrilamida de baixa porcentagem que serve para concentrar as amostras em uma única banda antes de entrar no gel de resolução. O gel de resolução é uma acrilamida de maior resolução que separa as proteínas por tamanho. A concentração de acrilamida está linearmente relacionada com o tamanho dos poros; uma concentração maior de acrilamida formará poros menores no gel. Poros menores são desejáveis para separar proteínas de baixo peso molecular.
Química de géis de poliacrilamida
PAGE usa um sistema de tampão descontínuo, no qual o íon do tampão do gel difere do íon do tampão de corrida. A diferença na mobilidade eletroforética entre esses dois íons forma um gradiente de voltagem móvel pelo qual as proteínas se deslocam. A química do gel de tris-glicina é o sistema de PAGE mais comumente usado, que utiliza géis compostos por tris-HCl e tampão de corrida composto por tris base e glicina. Géis de tris-glicina operam em um ambiente altamente alcalino que pode levar a modificações indesejáveis nas proteínas, como desaminação e alquilação. Como resultado, as bandas de proteína podem sofrer distorção ou perder a resolução em géis de tris-glicina.
Em contraposição, géis bis-tris usam bis-tris e HCl no tampão do gel e MOPS ou MES no tampão de corrida. Os géis bis-tris operam em um pH neutro que minimiza a modificação proteica e promove a estabilidade das proteínas durante a corrida do gel. Isso leva à resolução e precisão mais acentuadas da banda de proteína. Os géis bis-tris também têm uma validade maior do que os géis de tris-glicina, que começam a hidrolisar com o tempo. Os géis bis-tris também têm a flexibilidade de ser combinados com um tampão de corrida à base de MOPS ou MES, e a diferença na migração entre esses dois íons resulta em faixas de separação de proteína diferentes. MES deve ser usado quando a proteína de interesse é pequena (< 50 kDa) e MOPS deve ser usado para resolução de proteínas de tamanho médio a grande.
Também é importante considerar o tipo do tampão de amostra usado durante o preparo das proteínas. Em géis de tris-glicina, o tampão de Laemmli é tipicamente usado para desnaturar e revestir proteínas em íons de SDS com carga negativa. As amostras são fervidas a 100 °C para auxiliar a desnaturação. Aquecer o tampão de Laemmli a 100 °C torna o pH altamente ácido e esta combinação de calor e acidez mostrou provocar a clivagem das proteínas, preferencialmente nas ligações peptídicas Asp-Pro (Rittenhouse e Marcus, 1984). Isso faz com que os produtos de degradação das proteínas fiquem aparentes durante a eletroforese. Em contrapartida, os géis bis-tris usam um tampão de amostra de LDS que mantém um pH alcalino durante o preparo da amostra e não requerem aquecimento acima de 70 °C para desnaturação completa das proteínas. Este preparo mantém a integridade das proteínas, minimizando a clivagem das ligações peptídicas Asp-Pro.
| Tris-glicina | Bis-tris | |
|---|---|---|
| pH operacional | 9,5 (alcalino) | 7,0 (neutro) |
| pH do tampão de amostra | 5,2 | 8,5 |
| Frentes iônicas | Tris (+) glicina (-) | Tris (+) MOPS (-) MES (-) |
| Faixa de separação de proteínas | 6 kDa – 400 kDa | 6 kDa – 400 kDa |
| Estabilidade das proteínas durante a separação | Podem ocorrer desaminação e alquilação | +++ |
| Efeito nas ligações peptídicas Asp-Pro | Aquecimento prolongado no tampão de amostra de SDS provoca clivagem | O tampão de amostra de LDS usa condições de aquecimento leve e as ligações Asp-Pro permanecem intactas |
| Tempo de corrida | Moderado | Rápido |
| Validade | Limitada | Mais de 4 semanas |
Figura 1.Comparação dos géis de tris-glicina (esquerda) e bis-tris (direita). Os géis de tris-glicina e bis-tris foram moldados manualmente com acrilamida a 12% para polimerização de um dia para o outro. Os géis foram carregados com titulações idênticas de lisado de E. coli (pistas 3-6), padrão de proteínas não coradas de mPAGE® (pistas 2 e 7) e padrão de proteínas coloridas de mPAGE® (pista 1). Foi feita a corrida dos géis em tampão de corrida tris-glicina ou MOPS, eles foram corados com corante de gel para proteína ReadyBlue™ por uma hora e descoloridos com água desionizada por uma hora.
Moldagem manual de géis de poliacrilamida
Embora géis de poliacrilamida pré-moldados possam ser adquiridos para fins especializados, como análise de proteínas de tamanhos diferentes em um gradiente de acrilamida, muitos pesquisadores optam por moldar seus próprios géis de poliacrilamida manualmente. Géis de poliacrilamida moldados manualmente são baratos em comparação com géis pré-moldados; no entanto, o preparo dos reagentes e do equipamento de moldagem pode ser tedioso e /BR/ptdemorado. A variação no preparo dos tampões de gel também pode causar inconsistência no desempenho e na qualidade dos géis.
Kit de moldagem de géis bis-tris mPAGE® TurboMix
O kit de moldagem de gel bis-tris mPAGE® TurboMix elimina a variabilidade e a /BR/ptdemora de preparo dos géis moldados manualmente, fornecendo soluções tampão pré-misturado e de acrilamida. O kit inclui uma solução de resolução de acrilamida a 20% para formar a parte de resolução de um gel de acrilamida. A solução de resolução pode ser diluída com água desionizada até a porcentagem desejada de acrilamida, de 8% a 15%. O kit também inclui uma solução de empilhamento de acrilamida a 4% para formar a parte de empilhamento de um gel de acrilamida. Essas soluções são formuladas para permitir um método de moldagem rápida sem tempo de espera de polimerização entre despejar o gel de resolução e o gel de empilhamento. A seguir há um vídeo de /BR/ptdemonstração e um breve protocolo.
Vídeo de /BR/ptdemonstração: Molde os seus próprios géis de poliacrilamida usando os kits bis-tris mPAGE® TurboMix
PROTOCOLO DE MOLDAGEM RÁPIDA mPAGE® TurboMix
- Prepare o gel de resolução com a porcentagem desejada de acrilamida pipetando a solução de resolução mPAGE® TurboMix, água desionizada, persulfato de amônio (APS) a 10% e TEMED em um béquer ou tubo cônico de vidro limpo. Os volumes nas tabelas 2-4 podem ser multiplicados para moldar diversos géis de uma vez. OBSERVAÇÃO: Adicione APS a 10% e TEMED imediatamente antes da moldagem.
| (Para minigel com 1 mm de espessura) | |||||
| Gel de resolução | Gel de empilhamento | ||||
|---|---|---|---|---|---|
| Porcentagem do gel | 8% | 10% | 12% | 15% | 4% |
| Solução de resolução mPAGE® TurboMix | 2,4 ml | 3,0 ml | 3,6 ml | 4,5 ml | n/a |
| Solução de empilhamento mPAGE® TurboMix | n/a | n/a | n/a | n/a | 2 ml |
| Água desionizada | 3,6 ml | 3,0 ml | 2,4 ml | 1,5 ml | n/a |
| APS a 10% | 30 µl | 30 µl | 30 µl | 30 µl | 20 µl |
| TEMED | 3 µl | 3 µl | 3 µl | 3 µl | 2 µl |
| (Para minigel com 0,75 mm de espessura) | |||||
| Gel de resolução | Gel de empilhamento | ||||
|---|---|---|---|---|---|
| Porcentagem do gel | 8% | 10% | 12% | 15% | 4% |
| Solução de resolução mPAGE® TurboMix | 1,8 ml | 2,25 ml | 2,7 ml | 3,38 ml | n/a |
| Solução de empilhamento mPAGE® TurboMix | n/a | n/a | n/a | n/a | 1,5 ml |
| Água desionizada | 2,7 ml | 2,25 ml | 1,8 ml | 1,12 ml | n/a |
| APS a 10% | 22,5 µl | 22,5 µl | 22,5 µl | 22,5 µl | 15 µl |
| TEMED | 2,25 µl | 2,25 µl | 2,25 µl | 2,25 µl | 1,5 µl |
| (Para minigel com 1,5 mm de espessura) | |||||
| Gel de resolução | Gel de empilhamento | ||||
|---|---|---|---|---|---|
| Porcentagem do gel | 8% | 10% | 12% | 15% | 4% |
| Solução de resolução mPAGE® TurboMix | 3,6 ml | 4,5 ml | 5,4 ml | 6,75 ml | n/a |
| Solução de empilhamento mPAGE® TurboMix | n/a | n/a | n/a | n/a | 3,0 ml |
| Água desionizada | 5,4 ml | 4,5 ml | 3,6 ml | 2,25 ml | n/a |
| APS a 10% | 45 µl | 45 µl | 45 µl | 45 µl | 30 µl |
| TEMED | 4,5 µl | 4,5 µl | 4,5 µl | 4,5 µl | 2 µl |
- Prepare o gel de empilhamento pipetando a solução de empilhamento mPAGE® TurboMix em um béquer ou tubo cônico de vidro limpo separado e adicione a quantidade necessária de TEMED e APS a 10%. OBSERVAÇÃO: Adicione APS a 10% e TEMED imediatamente antes da moldagem.
- Misture delicadamente os reagentes, evitando introduzir bolhas de ar na mistura do gel.
- Com uma pipeta sorológica, encha cada cassete até a altura desejada com o gel de resolução.
- Posicione a pipeta sorológica no meio do cassete e adicione delicadamente o gel de empilhamento, enchendo até o topo da placa curta. Pode ocorrer uma depressão onde a pipetagem ocorre mas ela desaparecerá.
- Insira o pente rápida e cuidadosamente, evitando que bolhas de ar fiquem presas sob os dentes.
- Permita que os géis polimerizem por 1 hora.
- Os géis podem ser usados imediatamente ou acondicionados em folhas de papel toalha embebidas em água desionizada e armazenados em um recipiente hermético a 4 °C por até 4 semanas.
Preparo de amostras e corrida do gel
- Géis bis-tris requerem um tampão de carregamento da amostra de LDS, que é mais alcalino do que o tampão de amostra de SDS. As amostras podem ser reduzidas com o uso de ditiotreitol (DTT) ou β-mercaptoetanol, ou podem ser usadas sem redução dependendo da aplicação. Prepare suas amostras de acordo com a Tabela 5.
| Reduzida | Não reduzida | |
|---|---|---|
| Amostra | 6,5 - X µl | 7,5 - X µl |
| Água desionizada | X µl | X µl |
| Tampão LDS 4X Tampão LDS 4X | 2,5 µl | 2,5 µl |
| DTT 1 M | 1 µl | N/A |
| Volume total | 10 µl | 10 µl |
- Aqueça as amostras por 10 minutos a 70 °C (sem ferver).
- Carregue as amostras e o padrão de proteínas nos poços.
- Adicione uma quantidade igual de tampão de carregamento 1X nos poços vazios.
- Os géis podem ser corridos a 200 V até que o corante ou o padrão de proteínas atinja o fim do gel, em aproximadamente 30-60 minutos dependendo da porcentagem do gel.
Network error: Failed to fetch
Para continuar lendo, faça login ou crie uma conta.
Ainda não tem uma conta?
