Etapas e método de sequenciamento de Sanger

O que é o sequenciamento de Sanger?

O sequenciamento de Sanger, também conhecido como “método de terminação de cadeia”, é um método para determinar a sequência de nucleotídeos do DNA. O método foi desenvolvido por Frederick Sanger, duas vezes ganhador do Prêmio Nobel, e seus colegas em 1977, daí o nome Sequência de Sanger.

Para revisar a estrutura geral do DNA, consulte a Figura 2.

Como funciona o sequenciamento de Sanger?

O sequenciamento de Sanger pode ser realizado manualmente ou, mais comumente, de forma automatizada por meio de uma máquina de sequenciamento (Figura 1). Cada método segue três etapas básicas, conforme descrito abaixo.

Figura 1. Três etapas básicas do sequenciamento automatizado de Sanger.

Etapas do sequenciamento de Sanger

Há três etapas principais no sequenciamento de Sanger.

1. Sequência de DNA para PCR de terminação de cadeia

A sequência de DNA de interesse é usada como modelo para um tipo especial de PCR chamado PCR de terminação de cadeia. A PCR com terminação em cadeia funciona como a PCR padrão, mas com uma grande diferença: a adição de nucleotídeos modificados (dNTPs) chamados de dideoxirribonucleotídeos (ddNTPs). Na etapa de extensão da PCR padrão, a DNA polimerase adiciona dNTPs a uma fita de DNA em crescimento, catalisando a formação de uma ligação fosfodiéster entre o grupo 3'-OH livre do último nucleotídeo e o 5'-fosfato do próximo (Figura 2).

Na PCR de terminação de cadeia, o usuário mistura uma baixa proporção de ddNTPs de terminação de cadeia com os dNTPs normais na reação de PCR. Os ddNTPs não têm o grupo 3'-OH necessário para a formação da ligação fosfodiéster; portanto, quando a DNA polimerase incorpora um ddNTP aleatoriamente, a extensão é interrompida. O resultado da PCR de terminação de cadeia é de milhões a bilhões de cópias de oligonucleotídeos da sequência de DNA de interesse, terminadas em um comprimento aleatório (n) por 5'-ddNTPs.

No sequenciamento manual de Sanger, são preparadas quatro reações de PCR, cada uma com apenas um tipo de ddNTP (ddATP, ddTTP, ddGTP e ddCTP) misturado.

No sequenciamento automatizado de Sanger, todos os ddNTPs são misturados em uma única reação, e cada um dos quatro dNTPs tem um rótulo fluorescente exclusivo.

2. Separação de tamanho por eletroforese em gel

Na segunda etapa, os oligonucleotídeos terminados em cadeia são separados por tamanho por meio de eletroforese em gel. Na eletroforese em gel, as amostras de DNA são carregadas em uma extremidade de uma matriz de gel e uma corrente elétrica é aplicada; o DNA é carregado negativamente, portanto, os oligonucleotídeos serão puxados em direção ao eletrodo positivo no lado oposto do gel. Como todos os fragmentos de DNA têm a mesma carga por unidade de massa, a velocidade de movimentação dos oligonucleotídeos será determinada apenas pelo tamanho. Quanto menor for um fragmento, menos atrito ele sofrerá ao se mover pelo gel e mais rápido ele se moverá. Como resultado, os oligonucleotídeos serão organizados do menor para o maior, lendo o gel de baixo para cima.

No sequenciamento manual de Sanger, os oligonucleotídeos de cada uma das quatro reações de PCR são executados em quatro faixas separadas de um gel. Isso permite que o usuário saiba quais oligonucleotídeos correspondem a cada ddNTP.

No sequenciamento automatizado de Sanger, todos os oligonucleotídeos são executados em uma única eletroforese em gel capilar dentro da máquina de sequenciamento.

3. Análise de gel e determinação da sequência de DNA

A última etapa envolve simplesmente a leitura do gel para determinar a sequência do DNA de entrada. Como a DNA polimerase sintetiza o DNA somente na direção 5' a 3' a partir de um primer fornecido, cada ddNTP terminal corresponderá a um nucleotídeo específico na sequência original (por exemplo, o fragmento mais curto deve terminar no primeiro nucleotídeo da extremidade 5', o segundo fragmento mais curto deve terminar no segundo nucleotídeo da extremidade 5' etc.). Portanto, ao ler as bandas do gel da menor para a maior, podemos determinar a sequência de 5' a 3' da fita de DNA original.

No sequenciamento manual Sanger, o usuário lê todas as quatro faixas do gel de uma só vez, movendo-se de baixo para cima, usando a faixa para determinar a identidade do ddNTP terminal de cada banda. Por exemplo, se a banda inferior for encontrada na coluna correspondente a ddGTP, então o menor fragmento de PCR termina com ddGTP, e o primeiro nucleotídeo da extremidade 5' da sequência original tem uma base guanina (G).

No sequenciamento automatizado de Sanger, um computador lê cada banda do gel capilar, em ordem, usando a fluorescência para identificar a identidade de cada ddNTP terminal. Em resumo, um laser excita os marcadores fluorescentes em cada banda, e um computador detecta a luz resultante emitida. Como cada um dos quatro ddNTPs é marcado com uma etiqueta fluorescente diferente, a luz emitida pode ser diretamente associada à identidade do ddNTP terminal. O resultado é chamado de cromatograma, que mostra o pico fluorescente de cada nucleotídeo ao longo do comprimento do molde de DNA.

Figura 2. Esquema da estrutura do DNA. O DNA é uma molécula composta de duas fitas que se enrolam uma em torno da outra para formar uma dupla hélice. Cada fita é composta por uma cadeia de moléculas chamadas desoxirribonucleotídeos (dNTPs).

Cada dNTP contém um grupo fosfato, um grupo açúcar e uma das quatro bases nitrogenadas [adenina (A), timina (T), guanina (G) ou citosina (C)]. Os dNTPs são unidos de forma linear por ligações covalentes de fosfodiéster entre o açúcar de um dNTP e o grupo fosfato do próximo; esse padrão repetido de açúcar e fosfato constitui a espinha dorsal de açúcar e fosfato.

As bases nitrogenadas das duas fitas separadas são unidas por ligações de hidrogênio entre bases complementares para formar a hélice de DNA de fita dupla.

Como ler os resultados do sequenciamento de Sanger

A leitura adequada dos resultados do sequenciamento de Sanger dependerá de qual das duas fitas complementares de DNA é de interesse e de qual primer está disponível. Se as duas fitas de DNA forem A e B e a fita A for de interesse, mas o primer for melhor para a fita B, os fragmentos de saída serão idênticos à fita A. Por outro lado, se a fita A for de interesse e o primer for melhor para a fita A, a saída será idêntica à fita B. Assim, a saída deve ser convertida de volta para a fita A.

Portanto, se a sequência de interesse for “TACG” e o primer for o melhor para essa cadeia, o resultado será “ATGC” e, portanto, deverá ser convertido de volta para “TACG”. Entretanto, se o primer for melhor para a cadeia complementar ("ATGC"), o resultado será “TACG”, que é a sequência correta.

Resumindo, antes de começar, você precisa saber qual é o seu objetivo e como chegará lá! Portanto, tendo isso em mente, aqui está um exemplo do exemplo anterior (TACG -> ATGC -> TACG). Se os rótulos dos dideoxinucleotídeos forem T = amarelo, A = rosa, C = azul escuro e G = azul claro, você terá as sequências curtas primer-A, primer-AT, primer-ATG e primer-ATGC. Depois que os fragmentos forem separados por eletroforese, o laser lerá os fragmentos em ordem de comprimento (rosa, amarelo, azul claro e azul escuro) e produzirá um cromatograma. O computador converterá as letras, de modo que a sequência final seja o TACG correto.

Sequenciamento de Sanger vs. PCR

O sequenciamento Sanger e a PCR usam materiais de partida semelhantes e podem ser usados em conjunto, mas nenhum pode substituir o outro.

A PCR é usada para amplificar o DNA em sua totalidade. Embora fragmentos de comprimentos variados possam ser produzidos por acidente (por exemplo, a DNA polimerase pode cair), o objetivo é duplicar toda a sequência de DNA. Para isso, os “ingredientes” são o DNA alvo, os nucleotídeos, o primer de DNA e a DNA polimerase (especificamente a Taq polimerase, que pode sobreviver às altas temperaturas exigidas na PCR).

Em contrapartida, o objetivo do sequenciamento de Sanger é gerar todos os comprimentos possíveis de DNA até o comprimento total do DNA-alvo. É por isso que, além dos materiais de partida de PCR, os didesoxinucleotídeos são necessários.

O sequenciamento de Sanger e a PCR podem ser combinados ao gerar o material de partida para um protocolo de sequenciamento de Sanger. A PCR pode ser usada para criar muitas cópias do DNA a ser sequenciado.

Ter mais de um modelo para trabalhar torna o protocolo Sanger mais eficiente. Se a sequência-alvo tiver 1.000 nucleotídeos e houver apenas uma cópia do modelo, levará mais tempo para gerar os 1.000 fragmentos marcados. Entretanto, se houver várias cópias do modelo, em teoria levará menos tempo para gerar todos os 1.000 fragmentos marcados.